酵母双杂交.pptx

细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)
DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上有的激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合.
AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,
BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录.
一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达
。将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白,并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成
(1)与BD融合的蛋白表达载体,被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。往往是已知蛋白
(2)与AD融合的蛋白表达载体,被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题
⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等, 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助, 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题
二是假阳性较多,所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主