胚胎干细胞向心肌细胞分化中内皮细胞的作用.pdf

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胚胎干细胞向心肌细胞分化中内皮细胞的作用·基础研究·陈康辛仰勋沈卫峰【摘要】目的:研究胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,内皮细胞与心肌细胞之间的功能性联系。方法:通过检测一∈笈咛ジ上赴敌募一肌球蛋白重链—荧光蛋白表达情况变化,观察抑制内源性内皮细胞、添加外源性内皮细胞以及两者并存情况下,胚胎干细胞分化所得心肌细胞数量的变化。结果:谂咛ジ上赴分化过程中,加入外源性内皮细胞后,心肌细胞形成明显增多。匾煨砸种颇谠葱阅皮细胞,心肌细胞形成明显减少。庠葱阅谄は赴肱咛ジ上赴才嘌芄徊糠滞救由于内源性内皮细胞抑制所导致的心肌细胞形成障碍。结论:在胚胎干细胞分化过程中,内源性内皮细胞对于促进心肌细胞形成起着至关重要的作用,是形成心肌细胞发育微环境的关键因子。在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,外源性内皮细胞可以刺激心肌细胞形成,从而得到大量心肌细胞,具有潜在的临床应用价值。【关键词】胚胎干细胞;心肌细胞;分化;内皮细胞心肌细胞生活在血管微环境中,心肌细胞和内皮细胞在发育过程中几乎同时从生心中胚层产生。迄今为止,没有直接证据证明两者在胚胎干细胞分化过程中有着功能性联系。本研究通过添加外源性内皮细胞和抑制内源性内皮细胞方法,观察胚胎干细胞向心肌细胞定向分化的情况,探讨胚胎干细胞分化过程中两种细胞的关系,为内皮细胞应用于临床心脏疾病提供细胞学依据。牧嫌敕椒细胞培养一切∈笈咛ジ上赴怠P募√匾性患∏虻鞍字亓狹舳有蛄械骺赜ü蛋白表达,当狹表达时,荧光蛋白受其启动子驱动而表达,呈现绿色荧光表示心肌细胞顾刚吴立群痡..—...国际心血管病杂志年碌淼期,Ⅳ猣瓺,,篢篊籊.;籇;基金项目:国家自然科学基金项目作者单位:上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科·琂,—,—琒,琒,猰瓻癶”..琫—,..—:琫通信作者:沈卫峰,甤.,琋瑆’
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培养方法与以往实验基本相同⋯。即采用胚胎干细胞培养液培养,经过两次传代,生长在明胶铺被嘌笾校尤氚籽2∫种埔蜃。以保持胚胎干细胞的未分化状态。人类脐静脉内皮细胞琀悠昃猜瞿谄せ竦谩9髓微血管内皮细胞珺谴尤死喙撬柚蟹掷氲到的微血管内皮细胞。两者均采用培养液。细胞系生长在嘌褐校∈胚胎成纤维细胞嘌椒ㄓ隢嗤胚胎干细胞分化为拟胚体方法与以往实验相同【“。将雠咛细胞形成鲂危捎梅化培养液培养。经只纬赡馀咛搴笞R浦明胶铺被孔板中,每孔瞿馀咛澹分化培养液。荧光显微镜下每天检查一细胞系形成的心肌细胞,发现绿色有自我跳动能力细胞团,即认为是心肌细胞。胚胎干细胞与内皮细胞、以及细胞的共培养未分化胚胎干细胞和内皮细胞在各自培养液中,经胰蛋白酶处理,吹打形成单个细胞悬浮状态,转超速离心俅未荡蚣剖个未分化的胚胎干细胞与不同数量、、内皮细胞珺才嘌、同样与鑫分化的胚胎干细胞共培养。。内皮细胞抑制剂的使用将内皮细胞特异性抑制剂加入胚胎干细胞分化培养液中。转移拟胚体时再次加入,每慌嘌菏奔尤胄碌膃直到所有培养孔中出现绿色自主跳动细胞团。应用于以下两个实验:胚胎干细胞向心肌细胞定向分化实验;咛ジ上赴肽谄は赴赴才嘌笛椤半定量多聚酶链反应狿投慷嗑细胞分化第旎虻欤直鸫觘实验组和对照组收集拟胚体,用收集总莶僮髦改戏醋B,使用寡聚核苷酸引物扩增目的片段,对于下列基因进行检测:。.、痑—猚、、、、