目的要求通过唾液淀粉酶性质的测定,了解酶的专一性和多种因素对对酶促反应的影响,如:底屋的浓度,酶浓度,温度、PH值、激活剂等。通过对唾液淀粉酶活力的测定,学习酶活力、蛋白质含量的测定方法、及酶活力和比活力的计算方法。原理:一,考马斯亮法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’slaw)。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式,最大光吸收465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 二3,5—二硝基水杨酸比色定糖法 3,5----二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内,还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系,利用比色法可测知样品的含糖量。该方法是半微量测糖法,操作简便,快速,杂质干扰较小。三,研究底物,温度、pH、激活剂及抑制剂对酶促反应速度的影响在其他条件不变的情况下,当酶浓度一定时,增加底物浓度,反应速度随底物浓度而增加,两者成正比关系,即V=kC液。酶的催化作用受温度的影响很大,一方面与一般化学反应一样,提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10摄氏度,反应速度加快一倍左右,最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质,温度过高可引起蛋白质变性,导致酶的失活。因此,反应速度达到最大值以后,随着温度的升高,反应速度反而逐渐下降,以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时,反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37-40摄氏度,植物酶的最适温度为50-60摄氏度。但是,一种酶的最适温度不是完全固定的,它与作用的时间长短有关,反应时间增长时,最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时,在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定,一般利用恒温水浴等恒温装置。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定,能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶,一般不如固体的稳定,而且容易为微生的污染,通常很难长期保存而不丧失其活性,在高温的情况下,更不稳定。酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值,称为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时,酶的活性逐渐降低。不同酶的最适pH值不同,例如,-,胰蛋白酶的最适pH为8等。应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。例如,,但在磷酸缓冲液中,-,。酶的活性常受某些物质的影响,有些物质能使酶的活性增加,称为酶的激活剂;有些物质能使酶的活性降低,称为酶的抑制剂。例如,氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂,硫酸铜为其抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性,而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂,而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如,氯化钠达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活性。唾液
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