蛋白质一级结构测定.ppt

第四章蛋白质结构测定
◆数年后,美国科学家 Moore和 Stein 改进了Sanger 的方法,完成了第一个酶蛋白——核糖核酸酶的序列分析。
◆1955年英国科学家F·Sanger发表了胰岛素的全部氨基酸排列顺序,开创了研究蛋白质一级结构的新纪元。这是分子生物学发展进程中的一个重要突破。
第四章蛋白质一级结构测定
第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤
第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析
第三节末端氨基酸的测定
第四节肽链的专一性水解和肽段的分离纯化
第五节肽段的序列测定
第六节由已知序列肽段建立蛋白质一级结构
第七节蛋白质一级结构研究进展
第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤
一、序列测定的基本策略
二、序列测定前的准备工作
三、序列测定的一般步骤
一、序列测定的基本策略
两种或两种以上的特异性裂解法
2. 逐级特异性裂解
战略考虑关键
一是多肽链片断裂解方法的选择;
二是裂解后肽段的分离纯化;
三是要寻找接头肽段。
二、序列测定前的准备工作
(一)样品的纯度要求
(二)蛋白质的分子量测定
(三)构成蛋白质的多肽链的数目和大小
(四)蛋白质的氨基酸组成
(五)蛋白质的配基
(六)蛋白质的末端分析
蛋白质一级结构测定(重点)
指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。
测定的基本步骤:
(一).测定蛋白质纯度、分子量和浓度
(二).进行末端分析,确定蛋白质的肽链数目及N-端和C-端氨基酸的种类
(三).拆开二硫键并分离出每条多肽链
(四).分析每条多肽链的N-末端和C-末端残基组成和摩尔数
(五).用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离,以获得单一的碎片
(六).比较各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序
(七).二硫键和酰胺基位置的确定
(一)样品的纯度要求
一般要求纯度在97%以上,杂蛋白含量超过5%时便很难测定序列。
常用来检测蛋白质样品均一性的方法有:
①双向分析电泳; ②变性聚丙烯酰氨凝胶电泳;
③离子交换层析; ④N —末端氨基酸的测定;
⑤亲和层析; ⑥纯化至恒定比活;
⑦肽(酶)谱分析; ⑧Western 印渍法等。
(一)测定蛋白质纯度、分子量和氨基酸组成
1、样品的纯度与分子量
纯度>97%;
测定方法:
(1) SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide
gel electrophoresis,SDS-PAGE)
凝胶知识
丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacrylamide)聚合而成;
凝胶孔径:选择丙烯酰胺浓度,甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度;
凝胶有分子筛效应。
SDS-PAGE
SDS(sodium dodecyl sulfate)
阴离子洗涤剂,几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键,从而使多亚基蛋白质解聚,并使多肽链呈伸展状态,消除了蛋白质形状对迁移率(migration rate)的影响;
SDS 以 1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合,使变性蛋白质带上大量的净负电荷,而且电荷量与蛋白质分子量(即肽链长度)成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。