免疫共沉淀(immunoprecipitation,+ip).ppt

免疫共沉淀
(CO—immunoprecipitation)
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用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该
分子特异性结合的其他分子也会被带着一
起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证
蛋白质之间相互特异性结合。
免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细
胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。
基本原理
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细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗
原形成特异的免疫复合物,若存在与已知
抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中
还应包含这种蛋白质;经过洗脱,收集免
疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白
质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的
核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细
胞构建成cDNA文库,以上述核苷酸序列为
探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆。
实验流程
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(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适
量细胞裂解缓冲液(含蛋白免疫共沉淀酶
抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于
4°C, 最大转速离心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以备Western blot分析,
剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解
液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量
裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼
脂糖珠偶连;
(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000
rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;
将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲
液,沸水煮5分钟;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱
仪分析。
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一、样品处理:
二、抗体-agarose beads孵育
三、抗体-agarose beads复合物洗涤:
四、鉴定
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤
酶与病毒
信号传导
寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
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优点:
与蛋白质亲和层析一样,检测的产物是蛋
白质的粗提物;
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的
浓度存在,避免了过量表达所造成的人为效
应;
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在;
复合物以天然状态存在,蛋白的相互作用
可以在天然状态下进行,可以避免人为影响,
可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复
合体.
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局限性:
需要多克隆抗体或mAb,因而对大规模筛
选未知蛋白会遇到障碍。
免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合
物为直接相互作用的两种蛋白。
用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合
适,与Western blotting或者ELISA相比容易出
现假阳性反应。
灵敏度不如亲和色谱高。
不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结
构的蛋白质一蛋白质相互作用。
乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别
异丙醇和酒精都是有机溶剂,一般来讲,提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀,因为异丙醇沉淀的效果要好一些,但最后大多用酒精沉淀,因为酒精容易挥发,对下游的实验影响小 。    
异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子。 有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。  在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。      
异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。