rna的变性电泳原理.doc

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。%--%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样,但应明确一点的是,因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感,因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;另外,因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA非变性琼脂糖凝胶检测实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,(EB)10X载样缓冲液。实验步骤(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。(2)在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4ul于封口膜上。在实验台上再加入5ul1×TAE电泳缓冲液及1ul的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。(3)打开电源开关,调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。非变性电泳:上样量超过3ug,电压超过6V/cm,电泳缓冲液时间太长,均可能导致28S和18S条带分不开。使用2ug上样量,电压小于6V/cm,使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液,是获得好的电泳结果的前提。(以DNA标准为参照,。)变性电泳条带变淡:EB与单链的结合能力要差一些,故同样的上样量,变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂:(1)MOPS缓冲液(10*):(MOPS)(),,10mol/LEDTA。(2)上样染料:50%甘油,1mmol/LEDTA,%溴酚蓝,%二甲苯蓝。(3)甲醛。(4)去离子甲酰胺。电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。操作:(1)将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。(2)配制琼脂糖凝胶。①,置干净的100ml锥形瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。②待胶凉至60--70℃,依次向其中加入9ml甲醛、,混合均匀。③灌制琼脂糖凝胶。(3)样品准备:①取DEPC处理过的500ul小离心管,依次加入如下试剂:10xMOPS缓冲液2ul,,甲酰胺(去离子)10ul,,混匀。②将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。③向管中加入3ul上样染料,混匀。(4)上样。(5)电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,。(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。RNA提取、电泳注意事项,有几点说得很好啊快速的操作,低温环境,少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;%的DEPC水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧提取RNA所用的枪头,EP管。直接高压烘干即可。%DEPC处理,要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头,EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中,摇振过夜,然后倒掉depc注意要到干净,再高压,,,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,,先准备好干净的冻存管(,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,