H1N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析.doc

H1N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆与序列分析摘要从鸡胚尿囊液中提取H1N2亚型猪流感病毒的RNA,设计一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应成功地扩增了NS1基因。将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,所扩增的片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框,并将该毒株与参考毒株进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析。本文来源于网络,本站发布的论文均是优质论文,供学习和研究使用,文中立场与本网站无关,版权和著作权归原作者所有,如有不愿意被转载的情况,请通知我们删除已转载的信息,如果需要分享,请保留本段说明。关键词NS1基因;克隆;序列分析中图分类号Q781文献标识码A文章编号1007-5739(2008)22-0217-02 猪流感病毒是正粘病毒科A型流感病毒属中的成员,其基因组由8个RNA节段组成,其中NS基因是最短的,它含有2个读码框,可编码NS1和NS22种蛋白质。非结构蛋白NS1的基因序列高度保守,具有抗原性[1],在SIV检测中具有广阔的应用前景。本试验对该H1N2亚型猪流感病毒NS1基因进行克隆和序列分析,以期为后续研究提供参考。 1材料与方法 Trizol,载体pMD18-T、TOP10感受态细胞、RT-PCR试剂盒,AgaroseGelDNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒,限制性核酸内切酶和EcoRⅠ、XhoⅠ,T4DNA连接酶。猪流感毒株:A/Swine/Guangdong/1999(H1N2)。 ,参考已发表序列,设计如下一对引物:上游引物:5′-AACACTGTGC-3′;下游引物:5′-GGCTGCATGAATGTTATT-3′。 ,参照文献[2]相关方法,提取总RNA。将RNA溶于无RNase水中,置-70℃备用。 。在1μLRNA溶液中依次加入:MgCl24μL,10×RNAPCRBuffer2μL,,,,反转录通用引物Uni12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)1μL,AMVReverseTranscriptase1μL,共20μL,轻轻混匀,放入PCR仪中,30℃8min、50℃30min、99℃5min、5℃5min,所得产物即为cDNA。 。取5μLcDNA作为模版,依次加入MgCl26μL,10×PCRBuffer10μL,d2H2O76μL,Taq酶1μL,上、下游引物各1μL,共100μL,轻轻混匀。置PCR仪中,94℃预变性2min、94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸3min,进行35个循环,72℃延伸10s。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳。 -T载体试剂盒说明书进行DNA与载体质粒的连接,连接产物按常规方法转化TOP10感受态细胞。挑取白色可能的阳性菌落,提取质粒,进行PCR扩增和EcoRⅠ、XhoⅠ酶切鉴定。初步鉴定阳性克隆送生物公司测序。 。参考毒株包括Genebank中已公布序列A/Swine/Zheji