蛋白质晶体结构解析专业知识课件.ppt

(NMR)电镜技术核磁共振技术不需要获得生物大分子的晶体,适用于均一稳定的、分子量在30kD以下的生物大分子溶液,并且能够提供生物大分子的动力学信息近年来电镜尤其是单颗粒冷冻电镜三维重构技术的发展使得人们能够更方便地研究分子量在150kD以上的生物大分子,其分辨率能够到达3Å~4Å。X射线晶体学可以通过测定蛋白质分子在晶体中电子密度的空间分布,在一定分辨率下解析蛋白质中所有原子的三维坐标。1专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中,接近90%的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的。大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的。该技术还可用于测定蛋白质的二级结构。冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率(低于5埃)蛋白质结构的方法,该方法最大的优点是适用于大型蛋白质复合物(如病毒外壳、核糖体和类淀粉蛋白纤维)的结构测定。,首先需要得到适合于结构分析的蛋白质晶体,其需要满足两个条件:(1)晶体内部结构要具有有序性,只能是单晶,不能是孪晶,因为孪晶的两个晶体的衍射图样间的干涉和重叠而无法得到具有结构本身特点的衍射图样。(2)晶体要有一定的大小和形状,因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积,而反比于相对分子质量的大小。4气相扩散技术的悬滴法此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡,使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加,达到过饱和的状态,最终析出晶体。微量透析法微量批处理法5无论哪种形式,都要求X射线源的辐射密度尽量大,即单位面积的光强大。对同一晶体来说,只要蛋白质对辐射有一定的耐受力否则在收数据的过程中需要更换晶体,X射线源的强度越高,晶体的衍射强度也就越大,数据的误差也就越小。各种X射线源的光强大小关系是:X射线源封闭管的光强最弱,转靶X射线源的强度约为封闭管的一倍,同步辐射光强约为封闭管的一倍。除此之外,还要求X射线的发散度尽量小,这一点上同步辐射同样优于阳极靶式的X衍射仪。X射线源出来的射线经过单色器滤波片和准直器后,就可以得到单波长的X射线直线光束。7有了准备好的蛋白质晶体和单波长的X射线直线光束,就可以记录衍射数据了,数据收集方法主要有衍射仪法、回摆法、白光辐射法。目前主要采用的是回摆法来记录衍射数据。回摆法的特点是可以同时收集衍射空间的三维数据,因而同时记录更多的衍射数据,并缩短收集衍射强度的时间。8晶胞中分子堆积的这类基本信息对解决一些疑难的相位问题会有很大的帮助,下面分别介绍获得相位信息的3种主要方法:,一些有价值的分子之间堆积的信息可直接从结构振幅计算得出,而不必要预先知道任何相位信息。。当蛋白质晶体中引入了适当的重原子后,就造成该晶体衍射线强度的差别,从衍射强度的差别就可能推导出相位信息。10