质粒小量抽提.doc

质粒小量抽提质粒小量抽提1、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒(上海生工)(1)将过夜培养的菌液12000rpm离心15s,彻底去除上清;加500μl1×STE(或1×PBS)重悬菌体,12000rpm离心15s,彻底去除上清;(2)加入100μlSolutionI,用枪头或振荡器充分悬浮细菌;注1:如果不能够充分悬浮,呈现团块状,会使得细菌裂解不完全,降低产量;注2:此时可先将ddH2O放入60℃水浴进行预热。(3)加入200μlSolutionII,立即温和混匀(倾斜45°角,顺一个方向,慢慢旋转离心管),使细菌裂解,室温放置2min;注1:不能剧烈混合,否则会出现基因组DNA污染。加入溶液SolutionII进行裂解的时间,不要超过5min,以溶液由浑浊变清,同时变粘为裂解完全的标志;注2:天气冷时,SolutionII中的SDS会析出,故需要将其预热至清澈无沉淀。(4)加入350μlSolutionIII,立即上下颠倒5~10次,使之充分中和,室温放置5min;注:如果混有RNA,说明RNaseA处理不彻底,请减少菌体用量或加入SolutionIII后室温延长放臵时间5-10min。(5)12000rpm,离心10min;注:离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心,并延长离心时间,待完全沉淀蛋白后再取上清到吸附柱中。实际试验中,可以在室温以最高速(16000rpm)离心10-15min。(6)将步骤(5)-ml收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2min,8000rpm室温离心30s;注:不要吸取到沉淀,否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。(7)弃收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一收集管中,吸取500μlWashSolution到UNIQ-10柱,10000rpm室温离心1min;(8)重复步骤(7);(9)弃收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一收集管中,12000rpm室温离心2min,以彻底去除WashSolution;注:将离心后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5min,或自然晾干10min,有助于酒精的挥发,提高DNA的洗脱效率。(10)将UNIQ--ml离心管中,加入60℃预热的ddH2O30μl,60℃温育5min,10000rpm离心1min,离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。注:如需使质粒洗脱量多些,可重复一次步骤(10)。2、SDS碱裂解法制备质粒DNA:小量抽提(手抽)(1)挑转化后的单菌落,接种到2ml含有适当抗生素的丰富培养基中(LB、YT或Terrific培养液),于37℃剧烈振摇下培养过夜;(2),用微量离心机于4℃以最大转速离心30s,将剩余的培养物贮存于4℃;(3)离心结束,尽可能吸干培养液;注:吸取培养液时,尽可能使枪头远离细菌沉淀,以尽量避免吸走沉淀。1/3(4)(选)用冰预冷的STE()重悬细菌沉淀并离心后,除去上清。注:未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制酶切割或不能完全切割。这是因为培养液中的细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。这个问题可以用STE洗涤的方法解决。(5)将细菌重悬于100μl冰预冷的碱裂解液I中,剧烈