两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。采用3,5一二硝基水杨酸法测定酶活:(简称DNS法)1、原理:纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将3,5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基,溶液变为橙色的氨基化合物,即:3一氨基一5二硝基水杨酸,在一定的还原糖浓度范围内,橙色的深度与还原糖的浓度成正比,据此可以推算出纤维素酶的活力。2、采用的滤纸酶活单位定义:滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶,即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物,在一定反应条件(,50?,恒温lh)下,以水解反应中,1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位,以U表示。3、滤纸酶活力(FPA)的测定:?取0(5ml适当稀释的酶液,,-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml;?再加入50?(1cmx6cm)一条,于50?保温酶解反应1小时,(先预热5分钟);?加入DNS显色液3ml(),放入已沸腾的水中沸水浴lOmin,流水冷却后在540nm下测吸光度;?同时用100?煮沸lOmin后失活的酶液做对照,扣除本底;?根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算:X=(WxNxlOOO),(TxM)X:为滤纸酶酶活力,单位U,mL。W:为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。N:为酶液稀释总倍数。T:为反应时间。M:为样品的体积。4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制:取25ml具塞刻度试管6支,、、、、、,、、、、、,,混匀后在沸水浴中加热5分钟,取出立即用冷水冷却,用水定容至25ml,摇匀,测吸光度A,以吸光度为纵坐标,葡萄糖的含量为横坐标,绘制标准曲线。5、3,5二硝基水杨酸(DNS),5-二硝基水杨酸用水溶解,,182克酒石酸钾钠,加500ml水,,搅拌溶解,冷却,定容至1000ml,存于棕色瓶中,放置7天后使用。纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法1、定义:1毫升液体酶(或1克固体酶粉),在40?pH,,每分钟水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na),,即为1个酶活单位,以u/g(u/ml)表示。2、原理:CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖,还原糖能将3,5,二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,在540nm波长下测定吸光度值A,吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切β--葡聚糖的活力。3、试剂:,,醋酸钠缓冲溶液:
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