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江南大学
硕士学位论文
设计抗菌肽在大肠杆菌中的表达及其活性研究
姓名:韩晋辉
申请学位级别:硕士
专业:动物营养与饲料科学
指导教师:施用晖
20060601
脚,疊/疍全基因的合成及其克隆。根据大肠杆菌表达偏好密码子,将砌月门铂卸早崴奶跞ɑ蚝驮靥錚分别经双酶切及连接反应,得到重组质摘要素抑菌机理完全不同,细菌不易产生耐药性,因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。天蚕素是现有昆虫抗菌肽中最大的一族,具有抗菌谱广、毒副作用小、的通过分子改造或全新设计生产,表达高活性抗菌肽的研究受到限制。本课题在前期研究天蚕索保守序列的基础上设计了四条抗菌肽瓵倡/疍。本论文将通过基因息学方法初步分析抗菌肽的结构与抑菌活性关系,为今后设计、。重组质粒转化“感受态”大肠杆菌校菇ɑ鵌园工程菌綛,疍。测序分析表明四条抗菌肽全基因已经按照正确的阅读框插入到载体中。加入溴化氰裂解表达产物,除去其说娜诤系鞍准安糠中藕烹摹M肝龀バ》肿没有抑菌活性:,它们的最小抑菌浓度对四种抗菌肽的预测和抑菌活性的关系初步分析表明:疌仍二级结构都以抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多肽,广泛存在于生物体内。抗菌肽的抗菌机理与通过阻断细菌生物大分子合成的抗生结构简单等优点,但是目前天蚕素的抑菌机理、结构与功能关系还不十分明确,这使工程技术在大肠杆菌中表达四种抗菌肽,研究各抗菌肽的抑菌活性,并且利用生物信肽提供技术资料。—珺/疍多肽序列反翻译为核酸序列;采用分段化学合成的方法合成全基因序列的个危焕肞反应将短的瘟悠鹄矗⒁胂拗菩阅谇忻肝坏抗菌肽的诱导表达及溴化氰切割多肽。诱导工程菌并利用狿电泳鉴定表达产物,结果表明表达产物以包涵体的形成存在。正交实验优化发酵条件后,大量培养工程菌。收集并破碎菌体,待菌体破碎完全后离心法分离得到包涵体。洗涤包涵体,除去附着的细菌膜蛋白等杂质。用盐酸胍,盐酸溶解包涵体,并。后,冷冻干燥。利用稀释药敏实验和抑菌圈法测定设计抗菌肽抑菌活性。实验结果发现狝约为渲蠥—、两亲性、电场分布、跨膜区域进行预测。:抗菌肽基因工程抗菌活性结构预测摘要‘、
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签名:返际η┟签名:塾置璺日期.“年多月,日日期:独创性声明关于论文使用授权的说明磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编汇编学位论文,并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定:江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、保密的学位论文在解密后也遵守此规定。
第一章绪论抗菌肽研究进展细菌对抗菌药物的耐受性机制主要有四种:一、细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌胞内的抗生素,使之失去生物活性;二、抗生素作用的靶位绾颂翘搴秃说鞍由于发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法细菌耐药性的问题推动了人们寻求新型抗茵药物的决心。抗菌肽由于具有如下一机制不同于抗生素,不是通过作用于细菌某些特定位点来阻断其生物大分子的合成,高、种类多、抗菌谱广、不易引起耐药性等特点,近年来在各个研究领域都受到广泛早期的研究表明抗菌肽主要对细菌有高效广谱抗性,因此将其命名为抗细菌肽特性使它成为生物机体内不可或缺的重要成分【俊5侥壳拔V贡患ǔ龅目咕拇笤自年⑾智嗝顾刂螅髦痔烊弧⒑铣伞牒铣傻目股乇还惴应用于抵抗各种微生物的感染。随着这些抗生素的广泛使用,人们发现了多种产生耐药性的菌株,并且其数量还在逐年增加