血红蛋白的提取和分离预习学案.doc

思考:在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么?它的目的是什么?㈢电泳:1、概念:指发生迁移的过程。2、原理:许多重要的生物大分子,如等都具有在下,这些基团会带上。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的,从而实现样品中各种分子的分离。3、分类:①电泳②电泳。测定(蛋白质相对分子质量)通常用十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于。二实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理——粗分离——纯化——(1)红细胞的洗涤①目的:去除②方法:离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果),然后用胶头吸管吸出上层透明的,%的氯化钠溶液洗涤⑤低速离心(低速短时间)⑥重复4、5步骤次,直至上清液中已没有,表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化,不可洗涤次数过少。(2)血红蛋白的释放加到体积,再加40%体积的溶解细胞膜),置于上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10min,试管中的溶液分为4层:第1层(最上层):甲苯层第2层(中上层):的沉淀层,色薄层固体第3层(中下层):的水溶液层,的液体第4层(最下层):其它杂质的沉淀层(4))凝胶色谱柱的制作阴极阳极加入待分离的样品带电性质、分子大小和形状的不同,使分子迁移速分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图①取长40厘米,,两端需用砂纸磨平。②底塞的制作:打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网,再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞,中间打孔;b、在橡皮塞顶部切出锅底状的,,插入橡皮塞孔内,上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。,用的尼龙纱将橡皮塞包好,插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做,连接一细的,并用螺旋夹控制尼龙管的,另一端放入收集的收集器内③顶塞的制作:插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。2)凝胶色谱柱填料的处理(1)凝胶的选择:。(2)方法:配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后,配成。(3)凝胶色谱柱的装填方法1固定:将色谱柱处置固定在支架上②装填:将一次性的缓慢倒入内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。③洗涤平衡装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在高的操作压下,用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液()充分12小时。3)样品加入与洗脱(1)加样前:打开下端出口,使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐,关闭出口(2)加透析样