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第十三单元重组DNA技术本单元考点 (1)重组DNA技术相关的概念(2)基因工程的基本原理 (1)疾病相关基因的发现(2)生物制药(3)基因诊断(4)基因治疗(5)遗传病的防治重组DNA是指不同来源的DNA分子经过末端共价连接形成重新组合的DNA的过程。第一节概述一、相关的概念(一)DNA克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合称克隆。获取同一拷贝的过程称为克隆化,即无性繁殖。应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA连接,合成具有自我复制能力的DNA分子——复制子,继而经过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程,也称基因克隆或重组DNA。实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。(二)限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶能够把DNA切成长度不同的片段,是重组DNA中重要的工具酶。如BamHⅠ(三)目的基因应用DNA重组技术的目的: 分离、获取某一感兴趣的基因或DNA序列; 获得感兴趣基因的表示产物(蛋白质)。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。即纯化的特定基因(靶基因)。(四)基因载体游离的外源DNA是不能复制的,需将外源基因连接到有自我复制及表示能力的DNA分子上。基因载体:为携带目的基因,实现其无性繁殖或表示的有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。在重组DNA中常见的载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、柯斯质粒载体(粘粒)、病毒DNA和人工染色体等类型。载体分为克隆载体和表示载体为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表示载体。二、基因工程基本原理(一)目的基因的获取目的基因主要有以下几种来源: 。 ,得到所需DNA基因片断。 (PCR) 用体外快速扩增方法得到所需目的基因。 。(二)克隆载体的选择克隆载体的选择的标准: ①能自主复制; ②具有两个以上的遗传标记物便于重组体的筛选和鉴定; ③有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; ④分子量小,以容纳较大的外源DNA。(三)外源基因与载体的连接目的基因与载体DNA片段连接成一个完整的重组体分子。连接方式有以下几种: 。 。限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端。 。在末端转移酶的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。 。由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。(四)重组体DNA导入受体菌 (1)安全宿主菌。(2)限制酶和重组酶缺陷。(3)处于感受态。(在0-4℃下用氯化钙处理增加细胞膜的通透性成为感受态细胞)。 :转化、转染和感染。经过自动获取或人为地供给外源