实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定.ppt

实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定(酶活力、纯度及分子量测定)1实验内容1. 溶菌酶的粗提取2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定2背景知识溶菌酶(lysozyme):胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。生物学效应:主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活性可被一些金属离子Cu2+,Fe2+,Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制,能被Mg2+,Ca2+、NaCl所激活345溶菌酶理化性质:相对分子质量14700 Da,由129个氨基酸残基构,pI:~,最适温度为50℃,最适pH为6~7左右。:酶的提取、分离纯化?初步纯化(rough fractionation)(提取):把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程,即将尽可能多的酶,尽量少的杂质从原料中引入溶液。?高度纯化(fine fractionation)(精纯化):除去与产物性质相似的杂质。?纯化方案评价:酶活力、蛋白浓度、纯度7粗纯化(提取)目标:a. 将目的酶最大限度地溶解出来。b. 保持生物活性。?注意:温度升高,溶解度加大。但为防止酶失活,一般采用低温下(0~10℃)操作。提取原则a. 相似相溶。b. 远离等电点的pH值,溶解度增加。8离心分离(一)基本原理1. 离心力Fc = m ac=m rω2=m r(2? N/60)2 N为离心机每分钟转数(r/min );Fc通常以相对离心力RCF(relative centrifugal force)表示,即离心力F的大小相当于地球引力(重力常数g)的多少倍。一般用g(或数字?g)表示。RCF = m r(2? N/60)2 /mg= ?10-5 N2 r此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替r平均=1/2(r大+r小)cm9通常:?低速离心以每分钟的转数表示,如:4000r/min。?高速离心(超速),常以相对离心力(RCF)表示,如:65000g。两者可换算或查测算图。10名称转速(r/min)注意事项低速离心机?6000常温,注意样品热变性和离心管平衡高速离心机6000? 25000冷冻(防止温度升高),离心管的精确平衡超速离心机>25000冷冻+真空系统(减少空气阻力和摩擦),离心管的精确平衡离心机的种类