烟草abf转录因子基因的克隆及功能分析.pdf

烟草ABF转录因子基因的克隆及功能分析重庆大学硕士学位论文(学术学位)学生姓名:杨玲指导教师:夏庆友教授专业:生物学学科门类:eneinNicotianatabacumAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’:BiologyCollegeofLifeScienceChongqingUniversity,Chongqing,,2014中文摘要摘要干旱、低温和高盐等是影响植物生长的主要非生物胁迫因素,也是导致作物减产的直接原因,严重的情况下,甚至引起植物死亡。烟草是转基因重要模式生物,也是我国主要的经济作物,对功能基因组研究和经济发展均具有重要意义。在烟草整个生育期,对水分的要求很高,只有在充足的水份供应下,才能确保烟叶的产量和质量。然而在农业生产中,由于地理因素的限制和周期性气候变化,我国烟草农业遭遇了巨大的损失。分离鉴定烟草受非生物胁迫诱导的基因,对揭示烟草抗逆分子机制和烟草抗逆遗传改良均具有重要的意义。ABI5/AREB/ABF转录因子属于bZip转录因子的A亚族,特异存在于植物中,处于ABA信号转导途径的关键位置,功能涉及干旱和激素等逆境信号的传递。ABI5/AREB/ABF转录因子通过与胁迫响应基因启动子区ABRE元件相结合,调控胁迫响应基因表达,提高植物的抗旱性,因此,在非生物胁迫信号传递的过程中,ABI5/AREB/ABF转录因子充当了一个传递开关的作用,在植物抗逆境胁迫过程中具有重要作用。为揭示烟草抗非生物胁迫分子机制,培育优质的基因品种,本研究从栽培烟草“红花大金元”中克隆到2个烟草ABF类基因,NtABF1和NtABF2,并分别从其表达特性、启动子识别特异性、转基因植株抗非生物胁迫能力等方面对基因功能进行综合的评价,为揭示其在植物抗逆境胁迫中的功能和作用机理提供更多参考。主要实验结果如下:①烟草NtABF1和NtABF2基因的克隆及生物信息学分析从烟草品种“红花大金元”中成功克隆到2个ABF基因,NtABF1(GenBank登陆号KF736849)和NtABF2(Genbank登录号KF736850),对NtABF1和NtABF2生物信息学结果表明,NtABF1基因开放阅读框(ORF)长999bp,编码332个氨基酸,,;NtABF2基因ORF长1305bp,编码433个氨基酸,,。NtABF1和NtABF2均为含有BRLZ保守结构域的亲水蛋白,不含信号肽与跨膜结构。其高级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,β转角和延伸链含量较少。在亚细胞水平上,NtABF1和NtABF2均定位于细胞核。磷酸化位点分析表明,两蛋白均含有Ser,Thr和Tyr等激酶识别位点。进化分析和多序列比对结果表明,NtABF1与AtAREB3的进化关系最近,%;NtABF2与SlAREB1,StABF1,StABF的亲缘关系较近,%,%和83%。功能预测结果显示,NtABF1和NtABF2均为转录调控因子。②烟草NtABF1和NtABF2基因表达模式分析I重庆大学硕士学位论文NtABF1和NtABF2基因组织表达模式分析结果表明,NtABF1和NtABF2表达模式基本一致,在根中相对表达量最高,其次是茎、叶、花,在各组织中,NtABF1相对表达量均高于NtABF2。NtABF1和NtABF2基因逆境表达谱分析结果表明,NtABF2基因表达更易受到各逆境因素的影响:PEG、干旱、NaCl、低温、ABA诱导NtABF2上调表达,MeJA诱导NtABF2下调表达;NtABF1基因受PEG、NaCl、低温、ABA诱导,而干旱、MeJA抑制NtABF1基因的表达。③烟草NtABF1和NtABF2蛋白与ABRE元件体外结合能力分析成功构建了烟草NtABF1和NtABF2基因原核表达载体,pET28a-NtABF1和pET28a-NtABF2,转化表达菌TransRosetta(DE3),诱导目的蛋白表达,纯化目的蛋白,并通过EMSA实验体外检测目的蛋白分别与C-box及G-boxABRE元件结合能力,电泳结果表明,NtABF1和NtABF2蛋白均能特异识别并结合C-boxABRE元件,NtABF2与C-boxABRE元件结合信号较强,当适当提高NtABF2蛋白浓度后,能够检测到NtABF2与G-box元件特异结合信号。④烟草NtABF1和Nt