A型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1原核表达及间接ELISA方法建立.pdf

摘要禽流感严重威胁着世界的养禽业及人类的健康。许多国家采用多种疫苗来控制和消灭禽流感。随着疫苗的广泛使用,无法区分野毒感染和疫苗免疫的禽群,干扰了禽流感的检疫及其流行病学调查,掩盖了禽流感的流行,增加了禽流感的预防难度。研究表明,禽流感的非结构蛋白NSl在感染早期,就大量存在于病毒感染的细胞中,但在病毒粒子中却检测不到NSl蛋白。即NSl蛋自在病毒复制的早期就大量表达,仅出现于病毒感染的细胞内,而且能诱导机体产生针对NSl蛋白的抗体。这提示我们,NSl蛋白可作为一种鉴别诊断标志,通过检测抗NSl蛋白的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫的禽群,以此作为早期感染的依据。并且NSl蛋白作为A型流感病毒的非结构蛋白,具有高度的保守性,在临床应用中作为鉴别诊断免疫禽和自然感染禽的检测抗原具有广阔前景。本试验根据GeneBank公开发表的禽流感病毒(Avian Influenza V'mm,AIV)序列设计引物,用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白NSI的基因,并将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中,获得了重组表达质粒pET-NSI。将其转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,融合表达了NSl蛋白的基因。经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在。通过改变皿TG的浓度和诱导时间,确定了表达基因的最佳诱导条件:Ⅱ,诱导时间为5h。Western--blot分析表明:重组蛋白能与H9N2亚型AIV野毒感染阳性血清发生特异性反应,分离表达产物经His·bind柱子纯化后获得纯度较高的NSl蛋白。以此作为诊断抗原包被酶标板,建立了检测AIV抗体的间接ELISA方法。/”g/mL,血清的最佳稀释倍数为1:40,酶标二抗的最佳工作稀释度为1:2000。特异性试验表明:重组NSl蛋白除不与灭活疫苗免疫的禽血清反应外,也不与NDV,IBV,IBDV,EDSV感染的血清发生反应,具有良好的特异性。NSl蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫禽群,可作为一种鉴别诊断标记。NSl--ELISA方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。关键词:禽流感病毒;非结构蛋白;克隆;原核表达;间接ELISAThe Prokaryotic Expression of AIV NSl Geneand the Establishment of Indirect ELISA for NSl ProteinAbstractAvian influenza is seriously threatening the bird cultivation of the world and thehuman with gradual rating to avian influenza VIRUS research,thepeople have changed the research aspect from structural protein to the noastructuralprotein,which is the NSl protein has discovered that there is certainconnection between the NSl protein of avian influenza virus and apoptosis which iscaused by the avian influenza NSl protein’S adjusting the effect toapoptosis isdirectly related to whether the cell infected by avian influenza virus produces interferonor not,and to the cells it NSI protein call resistant the production ofinterferon produced by the viral infected cell,and has played a vital present,many countries apply various ines to control and eliminate the avian with the widespread applying of the vaecine,it is difficult to