双歧杆菌实验操作.doc

双歧杆菌的分离与鉴定一、实验背景双歧杆菌( Bifidobacterium )系 1899 年巴斯德研究院的 Tissier 首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一,还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。双歧杆菌为专性厌氧菌,对营养条件要求苛刻,活性保持相对比较困难。因此,研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品,本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及 PCR 检测,进行对双歧杆菌的分离与鉴定。二、实验步骤(一)材料 1、分离源母乳喂养的健康婴儿粪便 2、培养基和试剂 TPY 培养基、生理盐水、革兰染料(结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95% 乙醇、石碳酸复红液)、厌氧袋(硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠)、生化鉴定试剂管( F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺) 、双蒸水、 TaKaRa Taq 、 10× PCR Buffer(Mg2+Plus) 、 dNTP Mixture( 各 ) 、 16sRNA 90916 F、 16sRNA 90916 R、 3、设备 PCR 仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。(二)实验内容 1、样品的采集与处理(1) 用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约 lg,放入装有 9ml 生理盐水的无菌试管中, 充分振荡摇匀,做成 1∶ 10的均匀稀释液。另取 1 mL 灭菌的移液管吸取 1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有 9 mL 生理盐水的试管中,充分振荡摇匀,做成 1∶ 100 的均匀稀释液。按上述操作顺序,依次做成 1×10- 3~ 1×10- 7梯度的均匀稀释液。( 2)分别取 1×10-1~1×10- 7梯度的均匀稀释液在 TPY 培养基平板上进行划线分离(预实验),37℃厌氧培养 24~48h 观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好, 然后进行试验。(例如 1×10- 5~1×10- 7) 3、分离培养用接种环取 a、 b、 c 三种梯度的稀释液中的双歧杆菌进行 TPY 培养基平板划线分离, 每个梯度的稀释液划2块平皿,并做空白对照。 37℃厌氧培养 24~48h 。 4、革兰染色和镜检双歧杆菌经 24~48 h 培养后多数形成直径为 ~ 1mm 、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色不透明的菌落,菌体宽约 μm,长度在 1~6 μm之间,有弯曲和分叉现象, 形成双歧杆菌特有的“V”或“Y”结构[1] 。挑选平板上菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明、质地柔软的特征菌落[2] , 取菌落的一半进行涂片,然后进行革兰氏染色,如果挑选的菌落是革兰氏阳性、显微镜下具有双歧杆菌形态特征,如菌体形状不太规则,呈弧形、两端大小不一、 V 形或 Y 形的菌落,那么取菌落的另一半进行划线平板分离培养,再革兰染色和镜检。重复上述实验 2~3 次,直至出现分离出纯净的单个菌落。 5、生化鉴定取分离纯化的双歧杆菌菌落,分别接种在以上几种生化鉴定试剂管内,并用液态石蜡油封