五步蛇毒纤溶酶FⅡ抗DIC研析.pdf

中山大学硕士学位论文五步蛇毒纤溶酶FⅡ抗DIC的研究姓名:林熙申请学位级别:硕士专业:药理学指导教师:陈家树 20040517 五步蛇毒纤溶酶F II抗DIC的研究硕士研究生:林熙导师:陈家树教授中山大学基础医学院药理教研室摘要弥漫性血管内凝血(Disseminated intravascularcoagulation,DIC)是一种继发性的,以广泛微血栓形成并相继出现止血、凝血功能障碍为病理特征,严重可导致多器官的功能衰竭的临床综合征。在某些疾病或病理过程发生、发展过程中, 大量的促凝物质进入血流。在早期造成血管内凝血系统的广泛激活,纤溶系统的抑制引起血管内纤维蛋白沉着以及凝血因子和血小板大量消耗,加上随后由于继发性纤溶亢进,使机体的凝血功能发生明显障碍出现出血倾向。DIC病情发展迅速,预后差,死亡率高,DIC发病率约0,2‰一0。5‰,病死率高达50%一60%。耳前抗DIC的药物远不能满足临床治疗的需要,迫切需要寻找有效的抗DIC的新药。五步蛇毒纤溶酶F II对DIC的作用未见文献报道。本研究是以五步蛇毒纤溶酶FII为研究对象,探索FII在动物实验中对DIC的作用,为FII成为一种新型的抗DIC药物提供实验依据。一、五步蛇毒纤溶酶FII的制备 —SephadexA-50离子交换层析和两次Sephadex G-75凝胶过滤层析分离FII;SDS—PAGE垂直平板式电泳测定其纯度、分子量:纤维蛋白平板法测定FII的纤溶活性。结果:五步蛇毒粗毒经过DEAE—sephadex A-50离子交换层析得到6个蛋白峰,其中第二峰(FII)具有纤溶活性。第二蜂经Sephadex G-75凝胶过滤层析, 得到三个峰,其中第二峰(FII)有纤溶活性。再经Sephadex G-75凝胶过滤层析,得到一个蛋白峰,此即所需研究的五步蛇毒纤溶酶FII。409五步蛇毒粗毒得到FIl445mg,%。SDS-PAGE检测FII为单一区带,测得五步蛇毒纤溶酶FII的分子量为22,593。 :不同浓度FII作为给药组,生理盐水作为阴性对照组,尿激酶作为阳性对照组,分别与血浆混匀,37。C保温。反应后15、30、60分钟, 取出t00“1反应液,用纤溶酶活性检测试剂盒,测定血浆中纤溶酶的活性。结果:FII各个剂量组,血浆的405nm吸光度(A405nm)并没有随着时间的延长和剂量的增加而明显改变。尿激酶组,血浆的405rim吸光度(A405nm)随着时间的延长有明显改变。FII对人血浆中的纤溶酶原无激活作用。 。不同浓度的人纤溶酶、F11分别加入纤维蛋白平板表面,尿激酶和生理盐水分别作为纤溶酶原激活剂对照组和阴性对照组。37 ℃保温6小时,计算溶解面积。作图求人纤溶酶的量效关系。在此曲线上找到F 。结果:在加热纤维蛋白平板上,尿激酶组和生理盐水组不表现纤溶活性。人纤溶酶剂量依赖性地溶解加热纤维蛋白平板。()的纤溶活性与llU/m1人纤溶酶的纤溶活性相当。FII对纤维蛋白的溶解作用是直接的,不依赖于血浆中的纤溶酶原的存在。二、五步蛇毒纤溶酶FII抗DIC的作用采用Jose HERMIDA等的方法建立兔DIC模型。脂多糖以lOOug/kg/h的速度从兔的一侧耳缘静脉滴注的同时,对侧耳缘静脉给药。F (低剂量)、(中剂量)、(高剂量)三个剂量组;联合用药为组肝素30IU/kg/h+:阳性对照组为肝素30IU/kg/h;阴性对照组为生理盐水;另外一组为正常对照组。在给药前和给药2、6小时后分别予以动脉取血,分离血浆,测定给药前和给药后2、6小时的血浆的蛋白C、t-PA、PAl、纤溶酶原、ATIII的活性和纤维蛋白原含量,兔肾组织学检查以及观察实验兔6 小时内和24小时内死亡率。结果: :给药2小时后,蛋白C、纤溶酶原、 t—PA、PAl ±%、± II %、±%、+%、±%±%。给药6小时后,蛋白C、纤溶酶原、t—PA、PAI、ATII[±%、±%、±%、1