苏云金芽孢杆菌融合蛋白.pdf

中文摘要中文摘要随着生物科学的发展,苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)杀虫蛋白已广泛用于农业害虫的防治。但是由于Bt蛋白杀虫谱较窄,加之近年来害虫抗性问题的产生,严重影响Bt应用和发展。为了更好的抵抗害虫抗性的产生,通过构建Bt融合蛋白,来扩大杀虫谱,提高杀虫毒力。已有研究发现:(1)晶体蛋白CrylAc与Vip3Aal8蛋白具有不同的杀虫谱。 CrylAc蛋白对棉铃虫(HeBothis armigera)最具杀虫毒力,Vip3Aal8蛋白对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)最具杀虫毒力。而CrylAc蛋白对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua),Vip3Aal8对棉铃虫(Heliothisarmigera)均毒力较差。(2) 二者具有不同的杀虫机理。Vip3Aa蛋白与Cry晶体蛋白所结合的特异性受体及造成穿孔的具体机制不同。因此,通过基因重组技术,构建CrylAe-Vip3Aal8 融合蛋白,期望该融合蛋白能够兼具二者杀虫毒力,扩大杀虫谱,减缓害虫抗性发生。本实验,采用pET-28a(+)作为表达载体,通过Nde I和BamH I酶切位点将编码CrylAc三结构域核心片段的基因crylAcT连接到本实验室保存的质粒 pET-28a(+).坳成功构建pET-28a(+)一crylAcT-vip质粒。转入大肠杆菌BL21-pLysS 菌株诱导表达,通过western blotting确定分子量大小155kDa的蛋白为融合蛋白 CrylAcT-Vip3A。 ,对融合蛋白毒力特性进行研究。通过配体印记(1igand blotting)验证融合蛋白CrylAcT-Vip3A与棉铃虫 BBMV和甜菜夜蛾BBMV均具有很好的结合能力,并且融合蛋白与甜菜夜蛾 BBMV结合片段大小与Vip3Aal 8一致,与棉铃虫BBMV结合片段大小与CrylAc 一致。因此推测:融合蛋白在昆虫中肠内被酶解成CrylAcT和Vip3Aal8,两种蛋白各自发挥其杀虫活性。以Vip3A蛋白和CrylAc蛋白作为对照,采用本实验室人工饲养的农业害虫甜菜夜蛾、棉铃虫的初孵幼虫,对两个融合蛋白进行杀虫生物活性测定。结果显示,Vip3A蛋白对甜菜夜蛾的半致死浓度(LCso) ng/cm2,对棉铃虫的半致死浓度(LCso)为500 ng/crn2以上;CrylAc蛋白对甜菜夜蛾的半致死浓度(LCso)为500 ng/cm2以上,对棉铃虫的半致死浓度(LCso) ng/cm2;而中文摘要融合蛋白CrylAcT- ng/an2,对棉铃虫为 。说明该融合蛋白同时具备了Vip3A和CrylAc蛋白的杀虫毒力,能够同时对两种害虫具有高效杀虫活性,扩大了杀虫谱。然而,、棉铃虫的半致死浓度分别为162 n∥锄2,621 ng/cm2,对敏感昆虫毒力降低,其对抗性昆虫的毒力需要进一步的生测验证。关键字:CrylAc,Vip3A, 融合蛋白,甜菜夜蛾,棉铃虫 Abstract Abstract Withthedevelopment ofthebioscience,Bacillus thuringiensis insecticidal proteins havebeen extensively explored forbiological controlof the highly specificity ofBtproteins and thedevelopment ofresistance threaten their application and order to cope with these problems,genie bination technology was used toconstruct the fusionprotein toenlarge the insecticidalspectrum andresist theinsectresistance. Itisknown that:(1)Cryl Ac ishigll toxic toHeliothis armigera,whereas is lesseffective against Spodoptera ,the toxicity ofVip3A against these two insects isthedirect