石蜡包埋组织原位杂交操作规程.pdf

原位杂交操作规程
检测石蜡包埋组织 mRNA
注意事项:
RNase 污染
DEPC 处理过的双蒸水配制(双蒸水中加入 %DEPC,摇动放
置 3-4 小时,高压消毒灭活 DEPC 后备用)
RNase 污染
相关试剂配置
1. DEPC-PBS(DEPC 处理的磷酸盐缓冲液): 140mMNaCL;
KCL;10mM Na2HPO4; KH2PO4 (用 DEPC 处
理的双蒸水配置)
2. TE缓冲液:10mM Tris, 1mM EDTA,
3. 三乙醇胺(): 三乙醇胺 DEPC 处理的双蒸
水定容至 1L
4. 20 SSC ; 柠檬酸三钠 DEPC 处理的双
蒸水定容 1L
5. 100 Denhardt’s: Ficoll400 2g; PVP (聚乙烯吡咯烷酮)2g ;
BSA(小牛血清白蛋白)2g ; DEPC 处理的双蒸水定容至 100ml
6. 寡核甘酸探针杂交缓冲液: 配制 20ml(20 SSC 4ml ; 硫酸葡
聚糖 4g; 去离子甲酰胺 10ml; PolyA(10mg/ml) ; 鱼
精 ssDNA(10mg/ml) ; tRNA(10mg/ml) ;1M 二硫代苏
糖醇(DTT) 2ml;50 Denhardt’s (-20 保存使用前平衡到
37
7. 缓冲液 A: 100mMTris-HCL(); 150mMNaCL
8. 封闭液: 缓冲液 A 中加入 % Triton-X100 和 2%正常山羊血清
9. 缓冲液 B: 100mMTris-HCL() ;100mMNaCL; 50mM MgCL2
10. 缓冲液 C: 10mMTris-HCL() ;1mM EDTA



程序
1. 二甲苯脱蜡, 梯度酒精水化,DEPC 处理的 ddH2O 速洗两
次,DEPC-PBS(用 DEPC 处理过的双蒸水配制的磷酸盐缓冲液)洗 2
5 分钟
2. DEPC-PBS 稀释的 %Triton-X100 处理 15 分钟
3. DEPC-PBS 洗 2 5 分钟
4. TE 缓冲液稀释的 Rnase-free 蛋白酶 K(蛋白酶 K 用于石蜡切片的
建议浓度为 5-20 g/ml)在 37 孵育 10-30 分钟或者 HCL 稀
释的 %胃蛋白酶(胃蛋白酶用于石蜡切片的建议浓度为 100-500
g/ml)在 37 孵育 20-30 分钟(具体孵育时间需自行摸索)
5. 如果用蛋白酶处理,处理后 PBS+2mg/ml 甘氨酸洗 30 秒至 1 分钟,
然后 DEPC-PBS 洗 2 5 分钟;如果用胃蛋百酶处理,处理后
DEPC-PBS 洗 2 5 分钟
6. DEPC-PBS 稀释的 4%多聚甲醛后固定 10-15 分钟
7. DEPC-PBS 洗 2 5 分钟
8. 三