细胞培养实验写报告内容.doc

.页眉.. .页脚. 细胞培养实验写报告内容 1目的 2原理 3 材料与方法(操作步骤) 4 实验结果 5 结论或结果分析实验一鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验二滤泡性口炎病毒( VSV )的增殖(纯培养) 实验三 Hep-2 细胞的传代培养实验四 VSV TCID 50滴定实验五干扰素活性(效价)的测定实验六 VSV 中和试验(稀释血清固定病毒法) 实验二鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养一、目的 1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤; 2、掌握活细胞的显微镜下观察; 3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、原理离体动物组织通过温和的手段(机械和酶消化)形成单个细胞后,在适宜的外界环境中,包括温度、酸碱度和气相环境,并给予充足合适的营养条件,能生存、生长形成单层细胞,这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性, 比如肌肉细胞的收缩功能;上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性,因而对外界环境的变化也最敏感,因此比较适合病毒的增殖,药物的作用机制等的研究。三、材料(按 2人/组的量发放) .页眉.. .页脚. 名称数量备注 9~ 11日龄鸡胚 1只无菌器械 1套无菌无毒平皿 2只 5或 10ml 吸管 4支 1或 5ml 吸管 1支青霉素瓶(带塞) 2只 Hank s’液 250ml 1640 RMPI 或 DMEM 500ml 双抗 5ml 胰蛋白酶 1ml 小牛血清 5ml % NaHCO 3 3ml 碘酒和酒精棉球若干细胞培养瓶 2只四、操作步骤 1、在 DMEM 和 Hank ’s液中分别无菌操作以 1%的量加入双抗,吸出 10~ 15mlHank ’s液至无菌平皿中备用; 2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳; 3、取出两只无菌平皿,并标记①和②,待用。 4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳; 5、消毒镊子后小心撕破卵膜, 两人互相配合取出鸡胚置于盛有 Hank ’s液的平皿①中,小心去头、内脏、爪和粘液及血球,洗涤后置于盛有 Hank ’s液的平皿②中,再充分洗涤; 6 、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中,在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约 ~ 1mm 3的小块(约 250 次),此时体积约 ;用 Hank s’液洗涤两次。 7 、按照 10 倍量加入 %胰蛋白酶,调节 pH 至约 ~ (肉眼观为肉红色)盖上瓶塞,写好标记; 8 、将上述细胞瓶置于 37℃水浴中,开始计时,约 15~ 30min ,其间缓慢摇匀以充分消化。消化停止的标志是:轻轻晃动后细胞悬起,呈云雾状,很快聚集成团,表明细胞活力好。 9、消化结束后,取出,稍沉淀,缓慢吸出上清,用 Hank ’s液小心洗涤 2~ 3 次,可以尽量减少胰蛋白酶的残留量,然后加入 DMEM 液约 5ml ,用小头吸管充分吹打,使细胞充分分散。吸上清;重复操作 3~ 4 次,.. .页脚. 细胞上清。 10、(1)上述细胞悬液自然沉降, 待未消化彻底的组织块沉入瓶底后,收集上清,并加入足量的小牛血清(终浓度为 10%),将细胞密度调到约1×10 6个/ml 。(2)经四层无菌纱布过滤后收集滤液,并加入足量的小牛血清(终浓度为 10%),将细胞密度调到约 1× 10 6个/ml ; 11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到 2只细胞瓶中, 5ml/ 瓶,塞好螺口塞,注意生长面朝下,在非生长面上做好标记,包括细胞名称,接种培养时间,组别及姓名等。 12、细胞统一置于本室指定的 CO 2孵箱中培养。 13、24h 后观察细胞生长情况,如果细胞长成单层,细胞界限清晰,大多数细胞为梭形并贴壁,布满细胞瓶的生长面,说明细胞生长状态良好。实验三滤泡性口炎病毒( VSV )的增殖(纯培养) 一、实验目的掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、实验原理原代细胞最接近体内细胞的特性,因而对外界环境的变化也最敏感,因此比较适合病毒的增殖,药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应( cytopathic effect , CPE ), 常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。三、实验材料(按 2人/ 组的量发放) 名称数量备注 200TCID 50 VSV 5ml 和 1ml 吸管各 1支维持液 100ml 含3 %小牛血清的 RPMI-1640 液或 DMEM 液四、操作步骤 1 、上述原代成纤维细胞培养 24h 后,一旦细胞完全贴壁生长良好后,.. .页脚. 弃培养