生物检测技术——pcr技术解读.ppt

生物检测技术—— PCR 技术聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) , 体外核酸扩增技术。?能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, 使肉眼能直接观察和判断。? PCR 使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的 DNA 片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系,其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在 DNA 重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。 PCR PCR 技术的创建技术的创建 Kary Kary B. Mullis B. Mullis (穆利斯(美)) (穆利斯(美)) ?? Khorana(1971) Khorana(1971) 等提出在体外等提出在体外经经 DNA DNA 变性变性, ,与适当引物杂交与适当引物杂交, ,再再用用 DNA DNA 聚合酶延伸聚合酶延伸, ,扩增扩增 DNA DNA 的的设想。设想。? 1983 1983 年年,Mullis ,Mullis 发明了发明了 PCR PCR 技技术术, ,使使 Khorana Khorana 的设想得到实现。的设想得到实现。? 1988 1988 年年 Saiki Saiki 等将耐热等将耐热 DNA DNA 聚合酶( 聚合酶( Taq Taq )引入了)引入了 PCR PCR 技技术术?? 1989 1989 年美国年美国《《 Science Science 》》杂志杂志列列 PCR PCR 为十余项重大科学发明为十余项重大科学发明之首之首, ,比喻比喻 1989 1989 年为年为 PCR PCR 爆炸爆炸年年,Mullis ,Mullis 荣获荣获 1993 1993 年度诺贝尔年度诺贝尔化学奖化学奖。。 PCR 技术的原理? PCR 是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 片段的方法,反应原理与细胞内的 DNA 复制相似,但 PCR 的反应体系要简单的多,主要包括 DNA 靶序列、与 DNA 靶序列单链 3’末端互补的合成引物、四种 dNTP 、耐热 DNA 聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以拟扩增的 DNA 分子为模板, 首先高温变性,将混合物加热到 94 ℃维持 l5到 3O 秒,使模板 DNA 双链解旋成两条单链;然后逐渐降温退火,温度降到 55 ℃,使引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; 最后在引物、 DNA 聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成。如此循环 20 次原始 DNA 将扩增约 l0的六次方倍。经过扩增后的 DNA 产物多为介于引物与原始 DNA 想结合的位点之间的片段。 PCR 原理图 PCR 的基本成分? PCR 反应所需成分主要有模板 DNA ,一对核苷酸引物,缓冲液,四种三磷酸脱氧核苷酸,耐热的 DNA 聚合酶以及一些离子。?模板:就是需要扩增序列的核苷酸,来源很广,几乎所有形式的 DNA 和 RNA 都能作为 PCR 反应的模板。?引物:是与靶 DNA 的3’端和 5’端特异性结合的核苷酸片段, 是决定 PCR 特异性的关键。?缓冲液:要维持 PCR 反应的 pH ,必须用到缓冲液,最常用的是 10 ~ 50mmol /L的 Tris-HCl ,在 PCR 反应中, PH 值变化于 ~。?三磷酸脱氧核苷酸:四种三磷酸脱氧核苷酸( dATP , dTTP , dGTP , dCTP )是 PCR 反应的原料。四种各 dNTP 分子浓度必须相等,以减少错配。?耐热 DNA 聚合酶:耐热 DNA 聚合酶的发现,实现了 PCR 的自动化,能经受 95 ℃以上的高温而不失活。?其他成分:二价 Mg 离子能活化 DNA 聚合酶; DMSO 有利于 DNA 的变性; TMAC 可去除非特异扩增,促进 PCR ;甘油有利于 DNA 复性,不过并不是对所有的 PCR 都有利。 PCR 反应条件优化选择?首先是 PCR 反应循环阶段的优化选择:变性的温度和时间的控制,一般在第一轮循环前先进行 94 ℃预变性 3~ l0min ,以便使模板 D N A 完全解链,然后加入 TaqDNA 聚合酶趁热启动,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增;退火温度的控制,一般来说,退火温度越高,所得产物的特异性越高,但也不能太高,否则会影响引物与模板的碱基配对;延伸的温度和时间控制,一般延伸的温度设定在所用 DNA 聚合酶的最适温度附近,若不合适的温度, 不仅影响产物的特异性,也会影响产量;延伸时间不宜过长,否则会导致非特异性产物扩增带的出现。?然后是 PCR 反应成分的优化选择:模板核酸首先必须纯化,除去蛋白酶等杂质,浓度因反应不同而有所