重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定.doc

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定.doc重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的:学习在实现DNA体外重组过程屮,正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和日的DNA进行切割,产生利于连接的合适末端。学习设计构建重组DNA分子的基本方法,掌握载体和外源日的DNA酶切的操作。学习利JIJT1DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源口的DNA片段连接起来,构建体外DNA分子的技术,了解并掌握几种常用的连接方式。掌握利用Gael2感受态细胞的方法。°掌握(1互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入日的DNA片段的大小。学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术,了解引物设计的基木要求。实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术,这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下,有卜览2+、ATP存在的连接缓冲系统屮,将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起來。将重组质粒导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基中培养,可以通过a互补筛选法筛选出重组子,并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。重组子的构建酶切时首先要了解H的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能日的基因内部有专一的识别位点,否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的1=1的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常川的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法,即只川一•种限制性内切酶切削目的DNA片段,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端,再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现日的DNA片段以相反方向插入载体分子中,或1=1的D7A串联后再插入载体分子中,英至出现载体分子自连,重新坏化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选丁作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件,最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成,在双酶切体系屮,限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐,先低温后高温”的原则进行反应。(要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的DNA数量要适当。另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量,以及相皿的所需酶的量。可以适当增加酶的用量,但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%廿油的缓冲液中,如果酶切反应体系中甘汕的含量超过5%,就会抑制酶的活性。)连接反应总是紧跟酶切反应,外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5'-磷酸和3'-0H间形成磷酸二酯键。在分子克隆中瑕有用的DNA连接酶是來自T4噬菌体的T4DNA连接酶,它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时,载体DNA和外源DNA的摩尔数Z比控制在1:(广3)Z间,可以有效地解决D7A多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间,-般是16°C,用常用的连接时间为12-16ho感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞屮进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞,即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生