双交联剂体系氨基酰化酶交联聚集体的制备和研究分析.pdf

双交联剂体系氨基酰化酶交联聚集体的制备和研究 Preparationand Researchof Cross-linked Aggregates of Aminoacylaseby Using Dual Cross-linkers 学科专业:化学工程研究生:余舜雷指导教师:赵林教授企业导师:贾晓波高级工程师天津大学化工学院二零一二年六月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名: 签字日期: 年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年月日签字日期: 年月日摘要本文采用酶交联聚集技术,以戊二醛和乙二醇二缩水甘油醚混合共同作为交联剂,制备了氨基酰化酶()交联聚聚集体,探索了双交联剂体系制备交联聚集体的可行性并优化了反应制备工艺条件。得到如下结果: (1)采用乙醇、丙酮和乙二醇二甲醚三种有机溶剂作为沉淀剂沉降游离态的酶,乙醇的沉淀作用最好。当乙醇用量为90% V/V时,酶蛋白几乎全部被沉淀下来,酶活保留率为82%。丙酮和乙二醇二甲醚随也有着较好的沉淀效果, 但在沉淀过程中容易夺取酶分子表面的结合水,从而导致酶活性保留率的下降。(2)氨基酰化酶缺乏表面胺基,无法与戊二醛有效的交联。乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)是一种较为新颖的环氧型交联剂,交联机理与戊二醛不同,其环氧基团可以和胺基、巯基、羟基等多种基团反应。通过将戊二醛和乙二醇二缩水甘油醚混合共同作为交联剂使用,提高了氨基酰化酶的交联效率。当酶与戊二醛和乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1::2,在30℃下反应12个小时后, %的酶活保留率。(3)采用固定化技术,氨基酰化酶的操作稳定性得到明显提高。大量的酶分子团聚交联在一起,使固定化酶的整体结构比较稳定,热稳定性和耐热耐酸性能方面,固定化酶要明显好于自由酶。由于底物要克服更大的传质阻力才能到达酶颗粒的活性核心,固定化酶最适温度比自由酶高10℃。固定化酶的最适 ,。(4)固定化酶在重复水解5次后还保留着90%的初始酶活性,重复使用10 次后,还有72%的活力保留。冻干粉末在4℃下储存一个月,几乎没有酶活力损失,在缓冲溶液中4℃下存放15天后,仍有85%的酶活力保留。(5)自由酶热力学失活曲线符合经典一阶指数衰弱模型,而经过固定化后, 酶交联聚集体热力学失活曲线符合经典二阶指数衰弱模型。推测了酶热失活的机理,并从热力学角度解释了固定化酶稳定性提高的原因。关键词: 氨基酰化酶酶交联聚集体戊二醛乙二醇二缩水甘油醚 ABSTRACT In the present study, the cross-linked enzyme aggregate (CLEA) of aminoacylase (EC ) from Aspergillus melleus was prepared by precipitation with ethanol and cross-linking with glutaraldehyde and Ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE) as cross-linkers. The operational fessibility was studied and various cross-linked parameters were major contents were presented as follows: (1) Three kinds anic solvents, Ethanol, acetone and glycol hyl ether, were used as precipitating agents to precipite free aminoacylase. Excellent precipitationperformance was showed when the