分离-实验报告.doc

分离-实验报告.doc溶菌酶的分离纯化姓名:杨兴旭学号:060516211一、 实验目的(1) 利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶(2) 进行溶gf酶活力和比活力的测定(比浊法)(3) 进行溶菌酶纯度检测(SDS-PAGE)二、 实验原理溶幽酶(lysozyme,简称LZM)是由英国弗莱明在1922年发现的,它是一种有效的抗菌剂,全称为1,4-B-N-溶菌酶,又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸以和谷氨酸%,是一•种糖昔水解酶,能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡荷糖(NAG)与N-乙酰胞壁酸(NAM)间的P-1,4糖昔键,相对分子质量14700Da,由129氨基酸残基构成,由于其中含有较多碱性氨基酸残基,,最适温度为50°C,其最适PII在6〜7左右。在280nm的消光系数[二s]。该酶活性可被一些金属离子Cu”、Fe2\Zn2F(105-103M)以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制,能被Mg2\C/'(105〜10淅)、NaCl所激活。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内,鸡蛋(含量约为2%〜4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源,鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质,本实验以鸡蛋蛋清为原料,对溶菌酶进行提取并分离纯化。大多数从蛋清中提取分离得到的溶菌酶,是一种碱性球蛋白有4对二硫键维持酶构型,其分子由18种共129个氨基酸残基组成,分子量为14000Da左右。其纯品为白色、微黄色或黄色的晶体或无定型粉末,无嗅,易溶解于水,不溶于丙酮、乙醍等。、。溶菌酶非常稳定,、,其结构几乎不变。在酸性条件下,热稳定性很好。pH值在4、7时,100°C处理1min,仍保留较好的活力。但在碱性条件下,尤其当pH升至9时,溶留酶耐热性较差,易变性。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性,在中性条件下溶菌酶带正电荷,因此在分离制备时,先采用等屯点法粗分离,D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶,分光光度法测定酶活性及比活力,最后用SDS-PAGE鉴定。三、实验材料、试剂及仪器鸡蛋若干、D152大孔弱酸性阳离子交换树脂色谱柱、烧杯(100mL,250mL,1000mL)、锥形瓶(100mL)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒(100mL,250mL,1000mL)>10mL离心管、、高速离心机、冰箱、SDS-PAGE电泳设备、电炉、紫外分光光度计固体氯化钠(NaCl);固体硫酸铉(NHXSOi;固体磷酸氢二钠(Na2HP04•12H20);固体磷酸二氢钠(NaH2P04-);固体磷酸钠(Na3P04);乙醇;蒸馅水;甲醇;考马斯亮蓝;三氯醋酸;丙酮;溶幽酶标准品;N-乙酰葡萄糖胺;硫酸铜;硫酸亚铁;硫酸锌;氯化镁;氯化钙;氢氧化钠;盐酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂;聚乙二醇-20000>两性电解质试剂配制:30%丙烯酰胺贮存液:、,N,-甲叉双丙稀酰胺,加少量蒸馄水溶解后定再容至WOmLo过滤,放纵于4°C冰箱保存。分离胶缓冲液(=-HCl缓冲液):,加少量蒸馄水溶解,用1mol/(约48ml)后,定容至100mLo浓