,因此又叫做重组DNA技术。(一) “分子手术刀”一一限制性核酸内切酶(简称限制酶)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中 特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果:经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式: 黏性末端和平末端。(二) “分子针线”:根据酶的来源不同,可分为E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2•功能:恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键。★两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较:相同点:都缝合磷酸二酯键区别:,只能使 黏性末端之间连接;T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低。★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较卜暑曙DNA连接酶DNA聚合酶不同点1下七b2连接的=7^HeDNA]阿双链单链$模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相作用实形成磷酸二酯键同点质 j血化学本质蛋白质(三)“分子运输车”一一载体载体具备的条件:能在受体细胞中复制并稳定保存;具有一至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入;具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。基因工程常用的载体有: 质粒、噬菌体和动、植物病毒等。最早应用的载体是质粒,它是细菌细胞中的一种很小的双链 环状DNA分子。.(一)获得目的基因(目的基因的获取)获取方法主要有两种:①从自然界中已有的物种中分离出来,如可从基因文库中获取。用人工的方法合成。★获得原核细胞的目的基因可采取 直接分离,获取真核细胞的目的基因一般是 人工合成。★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR勺含义:是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术。(2) 目的:获取大量的目的基因(3)原理:DNA双链复制(4)过程:第一步:加热至90-〜95CDNA解链为单链;第二步::冷却到55-〜60C,引物与两条单链DNA结合;第三步::加热至70-〜75C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成(5)特点:指数形式扩增(二) 制备重组DNA分子(基因表达载体的构建)重组DNA分子的组成:除了目的基因外,还必须有 标记基因。★标记基因的作用:鉴定受体细胞中是否含有 目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。方法:同种限制酶分别切割载体和目的基因,再用 DNA连接酶把两者连接。(三) 转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内 维持稳定和表达的过程。常用的转化方法:将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是 农杆菌介导转化技术(农杆菌转化法),其次还有基因枪介导转化技术(基因枪法)和花粉管通道技术(花粉管通道法)。将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞:
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