基因工程载体质粒-文档资料.ppt

基因工程载体南京农业大学陈溥言1概述基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA,在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中,进行扩增和表达,研究基因结构和功能,基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。2载体基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区,该区经人工改造后可插入外源的DNA,并可送入宿主细胞中,使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。3目前的载体主要有:1,质粒(Plasmid)载体2,入噬菌体3,柯斯质粒(Cosmid)4,M13噬菌体5,杂交质粒6,病毒载体,包括穿梭载体(Shuttle)。7,细菌人工染色体.(bacterialartificialchromosome,Shizuya,1992BAC)8,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,Merry,1983YAC)9,来源于P1的细菌人工染色体(P1-derivedartificialchromosomePAC,loannon,1994)、10,哺乳动物人工染色体(MAC,mamalartificialchromosome,Farr,1991)11,人类人工染色体(HAC,humanartificialchromosome,Harrington,1997)12,植物人工染色体(PAC)4质粒载体(Plasmid)一词最早是由Lederberg,1952年提出的。是双链、闭环DNA复制子(replicon),存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类DNA。酵母的杀伤质粒(KillerPlasmid)是例外,它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在线状质粒。质粒是细菌复制所非必须的,也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型。5质粒载体质粒DNA的一般特点:①质粒DNA可在宿主菌中自主复制,又是细菌复制非必须的。②占总的基因组的1~3%。③所有原核生物都有质粒。④赋于细菌一种表型,是菌株特性不是菌种特性。⑤隐蔽质粒(Crypticplasmid)。⑥质粒都是双链闭环DNA复制子,酵母的杀伤质粒例外(RNA)。6质粒的一般生物学性质1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主要指在标准的培养基生长条件下,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数多少划分的。严紧型质粒,一般分子量较高;每个寄主细胞中仅含10~60个拷贝的质粒;松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复制不仅受自身的制约,而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制剂,一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1×109细胞/mL),加入氯霉素或壮观霉素,细菌染色体和严紧型质粒复制停止,而松驰型质粒经过10~12小时,每个细胞中可多达几百个,甚至几千个质粒。每个细胞中可达50%以上DNA是质粒DNA。严紧型(Stringentplasmid)和松驰型(relaxedplasmid)质粒7PUC质粒都属松驰型质粒。PACYC184等质粒属严紧型质粒。根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时,常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。(patibility)利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的生存,称为质粒的不相容性,有时又称不亲和性,是指在没有选择压力情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖过程中,其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基于质粒的不相容性质,在只带有一种质粒的细菌中,提取单一的DNA。(Conjugativeplasmid),又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传信息,又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。接合型质粒多属于严紧型质粒。非接合型质粒(non-conjugativeplasmid)也叫不能自我转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非接合型质粒多属于松驰型质粒。1)质粒的类型10