实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定.ppt

实验13溶菌酶的提取分离及鉴定(酶活力、纯度及分子量测定)、(lysozyme):胞壁质酶(muramidase)或N乙酰胞壁质聚糖水解酶(N--acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶生物学效应:主要通过破坏细胞壁中的N乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂內夲物逸岀而使细菌溶解。该酶活性可被一些金属离子Cu2+,Fe2+,Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制,能被Mg2+,Ca2+、NaC所激活N乙酸N乙胞壁酸溶菌酶作用位点B+·usaureuspeptidoglycanG·细胞壁肽聚糖组成缺壁0+:原生质体溶菌酶理化性质:相对分子质量14700Da,由129个基酸残基构,pI:-,最适温度为50℃,最适p为6~7左右。、分离纯化初步纯化(roughfractionation)(提取):把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程,即将尽可能多的酶,尽量少的杂质从原料中引入溶液●高度纯化(finefractionation)(精纯化):除去与产物性质相似的杂质●纯化方案评价:酶活力、蛋白浓度、纯度粗纯化(提取)目标:。。●注意:温度升高,溶解度加大。但为防止酶失活一般采用低温下(0~10°C)操作。。,溶解度增加。离心分离)=ma-mrw2=mr(2TN/60)2N为离心机每分钟转数(r/min);F通常以相对离心力RCF(relativecentrifugalforce)表示,即离心力F的大小相当于地球引力(重力常数g)的多少倍。一般用g(或数字xg)表示。RCF=mr(2N/60)2/mg=×105N2r此公式描述了相对离心力与转速之间的关系旋转半径用r平均代替平均1/2(r大+r小)通常:低速离心以每分钟的转数表示,如:4000min高速离心(超速),常以相对离心力(RCF)表,如:65000g。两者可换算或查测算图离心机的种类名称转速(r/min)注意事项低速离心机|<6000常温,注意样品热变性和离心管平衡高速离心机6000~25000冷冻(防止温度升高),离心管的精确平衡超速离心机|>25000冷冻+真空系统(减少空气阻力和摩擦),离心管的精确平衡