实验三 重组质粒dna转化大肠杆菌.ppt

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌1实验目的学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法为下一步重组体筛选做准备2实验原理遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞,使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力,从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来,这个过程就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,petentcells)。3转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。,在0℃低温处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形,DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击(如42℃)下,细胞可吸收外源DNA。为了鉴定这些转化子,须利用质粒编码的筛选标记,这些标记赋予细菌新的表型,是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因(Ampr),其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长,而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。4Ampr:氨苄西林抗性基因–β内酰胺酶多克隆位点(MCS):外源DNA片段的插入位点Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培养基上,可以生长。次日可见白色菌落--转化子。培养基上含有X-Gal和IPTG时,可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。pET32apET32a5结构的三大要素:多克隆位点选择标记(耐药性,LacZ)复制起始位点种类:质粒噬菌体酵母人工染色体(YAC)反转录病毒载体表达载体等67pET--32cloning/expressionregion9Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR1010