试验题目:突变体质粒构建——PCR法背景和原理:蛋白和蛋白间,蛋白和核酸间相互作用是后基因组学研究关键内容之一,而体外突变技术则是研究这种复杂关系一个有效手段。经过PCR方法可向目标DNA片段中引入任何所需改变,包含碱基添加、删除、点突变等。PCR定点突变快速、高效而且反复性好,是基因研究工作中一个很有用手段。其基础原理可简述以下图:产物I产物II第一轮PCR第二轮PCR退火延伸8个循环后加入引物1/引物4本试验拟在某基因编码区(CDS)内,经过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。该基因片段长724bp,,-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点,我们经过PCR法诱变又形成一个EcoRI酶切位点,能够经过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计以下:仪器、试剂及药品配方:仪器:PCR仪,电泳槽,水浴锅,凝胶成像仪,离心机,振荡培养箱,温箱,超净工作台,冰箱试剂及配方:试剂:DNA回收试剂盒,限制性内切酶(BamHI,EcoRI,XhoI),T4连接酶,DNA电泳markerPCR反应体系:(5μM)2μl下游引物(5μM):×()(TAE):工作液(1×)储存液(50×)40mMTris-乙酸242gTris/()LB液体培养基(1000ml)蛋白胨10g酵母抽提物5gNaCl5gLB固体培养基(100ml):PCR制备突变体片段::(5μM)2μl引物3(5μM)2μl引物2(5μM)2μl引物4(5μM):94℃1min94℃30S30循环55℃1min72℃30S72℃:~3μl产物II2~3μl引物1(5μM)2μl引物4(5μM)2μl水补足至25μl注:引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。反应条件:94℃1min94℃30S35循环(第8个循环后暂停加入引物)55℃1min72℃30S72℃5min凝胶回收:配制琼脂糖凝胶;DNA琼脂糖凝胶电泳;紫外灯下截取对应DNA片段凝胶,;每管加入500μl溶液A,55℃水浴融化10min,其间可振荡助融2-3次;融化后,每管加入15μl溶液B,混匀,加入离心柱;离心1rpm,30s;弃下管液,每管加入500μl溶液C,离心1rpm,30s;反复步骤g(弃下管液,每管加入500μl溶液C,离心1rpm,30s)弃下管液,离心1rpm,30s;将离心柱置于新dorf管中,室温敞开离心管盖2-3min,每管加入25μl溶液D,室温放置2min;离心1rpm,1min。酶切体系::酶切片
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