谷胱甘肽转硫酶的制备.ppt

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究
实验内容：
（一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶
（二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度
（三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力
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课前思考题
1. 关于谷胱甘肽转硫酶。
2. 生物大分子的制备前期实验材料的预处理和蛋白质的提取方法。
3. 亲和层析的原理，影响亲和层析的因素。
4. 关于配基、载体及配基的偶联。
5. 本实验中Buffer A和B中各组分的作用是什么？
6. 实验中应注意的问题。
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谷胱甘肽转硫酶简介
谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。
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兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
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GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS－反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。另外，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。
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亲和层析原理
有很多生物大分子与相应的分子间具有专一的可逆结合的特性，如酶与其底物、抑制剂、辅助因子，抗体与抗原，核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白，激素与其受体、载体蛋白，细胞与其表面特异蛋白等等，它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力的称为亲和力。亲和层析的方法就是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和发展起来的。
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将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被分离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待分离物质，通过解吸附使待分离物质得以纯化。

亲和层析的优点：专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质；具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品；利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。
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亲和层析法分离生物大分子示意图
配基 待分离的
生物分子
a.
载体 手臂 配基 亲和吸附剂
b.
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d.
与待分离物质专一可逆结合的物质
c.
样品
杂质
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亲和层析介质的制备
配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节，配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联率，偶联后配基和被分离生物大分子的专一结合特性不变，有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活性和理化性质。
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