整个基因克隆实验流程(完整).docx

一、 组织总RNA的提取
相关试剂：Trizol ;氯仿；苯酚；异丙醇；75汇醇；RNase-free水
相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、 200卩l、100卩1/50卩l ）;涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml, 200卩l/300卩l ）, 一次性手套，实验手套。
实验步骤
取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道 50~100mg放入研钵中，加入液
氮迅速研磨，然后加入 1ml预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
转移到离心管中，室温放置 5min，使细胞充分裂解；
按1ml Trizol 加入200卩l氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀 15s，然后室温放置 3min ；
4C，,12000g 离心 15min ；
此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无
色水相中；
小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；
室温放置 10min ； 4 C，,12000g 离心 10min ；
弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀;
弃上清；可以再次用 75%乙醇洗涤沉淀；
弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，
DNA污染；转移至一个新的离心管,
4C，,12000g 离心 5min ；
注意不要吸取沉淀；室温放置5min
晾干沉淀；（RNA羊品不要过于干燥，否则极难溶解）
RNase-free 水，轻弹管壁，使 RNA溶解。
RNA质量检测
相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB
相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（卩l或2卩l规格，10卩l规格），电
子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）
相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCRt, PCRt架，锥形瓶，烧杯， 一次性手套，实验手套，冰盒）
（1） RNA纯度的检测：测定其 0阪和0阪的值，根据其 OD60/ OD 280的比值，当其比值在 ~ 之间，说明提取的总 RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
（2） RNA完整性的检测：取 2卩1RNA，与2卩I溴酚蓝混匀，用1%勺琼脂糖进行凝胶电泳， 20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当 28S与18S条带清晰，且亮度比大约是 2:1时， 5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
二、 逆转录（RNA逆转录成cDNA
相关仪器：（PCF仪/恒温金属浴，移液器（卩I或2卩I规格，10卩I规格），100卩I 冰盒，制冰机，PCRt）
根据逆转录试剂盒（TOYOB公司）说明书进行，反应体系及条件如下:
试剂
使用量（卩I ）
Rnase Free H 2O
OIigo (dT)
1
Total RNA ( <1000ng)
Y
Total Volume
65 C， 5min后，立即置于冰上。
试剂
使用量（卩I ）
上一步变性后RNA溶液
5 x RT Buffer
4
dNTP Mixture (各 10mM
2
Rnase Inhibitor (10U/ 卩 I )
Rever Tra Ace
1
Total Volume 20
然后放置于PCR仪上，反应程序为： 42 C,60min ; 99C ,5min ; 16C,5min。所得cDNA放置
于-20 C保存。
PCR反 应
相关仪器：（PCF仪/恒温金属浴，移液器（卩l或2卩l规格，10卩l规格），100卩l
电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
试剂 使用量（卩l）
ddfO
反转录产物
10 x PCR Buffer
dNTP( 10mmol/l )
Taq 酶(1U/ 卩 l )
95 C ,预变
94 C变性
火 30s，72 C
35个循环；
Ghrelin-F (10 mol/l )
反应条件：
Ghrelin-R (10 mol/l ) 性 3min ;
MgCb (25mmol/l )
30s，55 C 退
Total Volume 10
延伸45s，共 72 C 延伸 10min。
反应结束后，取5卩l PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
四、 PCF产物的分离，回收和纯化
相关试剂：胶回收试剂盒
相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200卩l ,1ml规格），离心机，恒温金属浴,
涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）
相关耗