恙虫病东方体快速检测方法的建立和评估.pdf

摘要摘要恙虫病(scrub typhus)是由恙虫病东方体(orientia tsutusgamushi)通过恙螨幼虫叮咬而传播的一种自然疫源性疾病。据调查,在亚太地区,大约10亿人群有潜在感染风险,每年约100万新病例出现。由于自然疫源地不断扩大,恙虫病感染已经成为亚太地区一个亟需解决的公共卫生问题。本病临床上以突发高热、淋巴结肿大、虫咬溃疡和皮疹为主要特征,轻者呈自限性流感样综合征,严重者脏器衰竭甚至死亡。若及早诊断并服用抗生素治疗,可避免并发症。但由于恙虫病的临床症状和其他热性传染病有诸多相似,极易引起误诊。传统的血清学检测法间接免疫荧光试验被称为“金标”,但需制备菌体抗原,步骤操作繁琐复杂,并且需要生物安全实验室和熟练的技术人员,在基层医疗单位应用受到很大的限制。因此,建立简便、准确、快速、敏感, 适合在偏远地区、条件相对简陋的现场使用的恙虫病诊断方法,是极其必要的。近年来,随着分子生物学的发展,大量制备高纯度重组抗原成为可能,使得血清学方法检测病原体感染更为便捷,应用前景更为广阔:与血清学方法比较,核酸检测方法可以大大缩短病原体感染的“窗口期”,能更早期确诊病原体感染。恙虫病东方体外膜蛋白56kD是最重要的病原体结构蛋白,已被研究者视为恙虫病免疫学和核酸检测的重要靶标。本研究通过PCR选择性扩增出东方体合肥株和三界株编码56 kD外膜蛋白部分截短基因,克隆至原核载体pET28a构建表达载体,对重组表达产物进行活性鉴定分析;以合肥株和三界56 kD截短重组混合抗原作为诊断抗原,制备胶体金免疫层析诊断试剂,通过检测血样中恙虫病东方体的IgM和IgG评估其检测效能;同时,以56l①外膜蛋白基因为靶基因,研究构建了可视化环介导恒温扩增法和染料荧光定量PCR法,实现恙虫病东方体的早期灵敏检测。本研究建立的血清学和核酸检测方法均具有较好的敏感性和特异性,其中荧光定量PCR可用于恙虫病感染的实验室早期快速诊断,并可以定量评价体内东方体的感染滴度,而胶体金免疫层析法和可视化环介导恒温扩增法适用于农村、基层医院及现场的快速筛查。上述检测方法的建立可为恙虫病早期及时诊治提供技术支持。关键词:恙虫病;东方体;诊断;环介导恒温扩增法;染料荧光定量PCR法;胶体金免疫层析法 Abstract Abstract Scrubtyphus is an acute febrileillnesscaused by Orientia tsutsugamushi infection following thebiteofinfected that one billionpeople are atriskand one million new cases ariseannually intheAsian-Pacific infectious diseasehasrecently e animportant public healthissue due toregional outbreaks and new presentations ofscrub typhus,typically characterized by eschar, fever,rash,lymphadenopathy,and ulceration,Can vary inseverity from amild and self-limiting flu—likesyndrome to alife— earlydiagnosis and immediate antibiotic treatment are important toprevent plications inscrub typhus,the clinicaldiscrimination ofscrubtyphus from otherundifferentiated fevers,is oftenvery difficultbecause theclinicalsymptoms ,diagnosis of scrub typhus requires laboratory confirmation,usually serologic detection ofantibodies against thebacterialpathogen during the acuteand convalescent phases ofthediseaseand thegold standard is theindirectimmun