谷胱甘肽含量测定.doc

【实验目的】
了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
【实验原理】
谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
【器材与试剂】
实验仪器与用具
研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计
实验试剂
还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液； 蒸馏水。
实验材料
小麦叶片
【实验步骤】
标准曲线制作
取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。
试剂（ml）
试管号
1
2
3
4
5
6
7
10μg/ml GSH标准液
0






蒸馏水







pH7磷酸缓冲液







DTNB试剂







GSH浓度 μg/2ml
0
1
2
4
6
8
10
提取
取材后，，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。
测定
取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。
显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。

GSH含量（μmol/g）=（Cx×Vt）/ （FW×VS）
式中，Cx为2ml样品中GSH的含量（μg）；Vt为样品提取液总体积（ml）；Vs为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。
【实验结果】

试管编号
1
2
3
4
5
6
7
GSH浓度（μg/2ml