白藜芦醇联合蛋白酶体抑制剂对白血病治疗作用及其机制的研究论文.pdf

中国医科大学硕士学位论文白藜芦醇联合蛋白酶体抑制剂对白血病的治疗作用及其机制研究姓名:牛小芳申请学位级别:硕士专业:基础医学;生物化学与分子生物学指导教师:王华芹 201203 ·中文论著摘要· 白藜芦醇联合蛋白酶体抑制剂对白血病的治疗作用及其机制研究目的白血病是一种造血系统的恶性病变,其主要表现为异常的自血病细胞及其幼稚细胞在骨髓及其他造血组织中进行性的异常增生,发病机制目前尚不完全明确。(UPS)是真核生物体内进行蛋白选择性降解的主要通路。由UPS介导的蛋白质降解通路的严密调控在细胞周期中蛋白质半衰期的调控、转录调控、抗原提呈、血管发生、以及移除错误折叠或受损的蛋白质等过程中均发挥重要作用。研究表明,蛋白酶体抑制剂通过对泛素化通路的阻断可诱导多种包括白血病的人类肿瘤的细胞凋亡,是一类很有发展前途的抗肿瘤药物。由于人工合成的化疗药物在治疗肿瘤方面存在局限性,近年来一些从植物中提取的天然抗肿瘤药物得到了科研界、医疗界的广泛关注。自藜芦醇是富含于葡萄皮、花生、红酒等中的一种天然多酚类化合物,白藜芦醇在抗肿瘤、抗炎、肝脏保护、神经保护、心血管保护和免疫调节等方面均发挥重要作用。已有大量报道表明,单独应用大剂量(通常大于50pmol/L)的白藜芦醇能够抑制人类肿瘤细胞的生长。另外已有报道,白藜芦醇联合某些化疗药物治疗肿瘤, 不仅能够降低化疗药物的毒副作用,而且能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究探讨蛋白酶体抑制剂单独及联合白藜芦醇在白血病细胞凋亡过程中的影响作用。方法 l、单独使用MGl32或联合白藜芦醇处理白血病细胞 2、MTT法检测细胞活力 3、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期 4、蛋白印迹法检测蛋白PARP剪切水平 5、实时定量PCR和蛋白印迹法检测p27脚1和FOX01的表达水平 6、染色质免疫沉淀法检测结合到p27rapl启动子的FOX01水平结果一、白藜芦醇能够对抗MGl32对K562的细胞毒性效应 MTT结果显示1-20pmol/L的白藜芦醇对K562细胞活力无影响,而大于 509mol/L能使细胞活力明显下降;K562细胞活力对MGl32呈剂量依赖性下降;白藜芦醇能够对抗MGl32呈剂量依赖性诱导的细胞活力变化,2pmoFL具有明显的抑制效应,5-201maol/L显示出最大效应;即使选用毒性剂量()的白藜芦醇仍然能够有效对抗MGl32的细胞毒性。AnnexinV/Pl双染证实MGl32能够明显诱导K562细胞凋亡,1009mol/L藜芦醇单独处J里K562细胞24h仅诱导了12%的细胞凋亡;联合白藜芦醇能够明显对抗MGl32诱导的细胞凋亡。Western Blot显示, 联合白藜芦醇能够明显的抑制由MGl32诱导的PARP剪切成89kDa片段。二、白藜芦醇能够降低蛋白酶体抑制剂对白血病细胞的毒性效应流式AnnexinV/PI双染结果显示,白藜芦醇同样能够对抗MGl32对NB4,U937, Daudi和Raji细胞凋亡作用,三种不同结构的蛋白酶体抑制剂(PSI,lactacystin, epoxomicin)能够诱导I(%;同时5岫。儿自藜芦醇对三种不同结构的蛋白酶体抑制剂都有明显的对抗作用。三、白藜芦醇对抗MGl32诱导的细胞毒性效应过程中涉及到 p27脚1介导的G1/S阻滞使用51amol/L白藜芦醇、5lmaol/L MG 32分别处理K562,NB4,U937,Daudi 和Raji细胞24h后,流式PI单染结果显示前者S期细胞数增加,后者S期和G2/M 期细胞数均增加。与MGl32单独作用相比,联合白藜芦醇之后S期细胞数降低, 而G1期细胞数增加。Westernblot显示,与对照组相比,白藜芦醇、MGl32单独 2 作用于K562细胞,均增加了p27脚1的表达,二者联合使用时更多地增加了p27鼬p1 的表达。与对照组相比,敲低p27脚1后微弱地对抗了MGl32单独诱导的细胞凋亡,重要的是,在p27脚1敲低细胞中自藜芦醇对MGl32作用的拮抗明显削弱。四、白藜芦醇$【1MGl32通过FOX01诱导p27确p1上调实时定量PcR显示,单独使用白藜芦醇促进mRNA水平p27瞄P1表达增加,而 MGl32对其无明显作用。两者联合使用,更能显著地增加mRNA水平p27脚1的表达。首先用RNA合成的抑制剂放线菌酮D预处理细胞,然后使用白藜芦醇单独或联合MGl32,结果显示放线菌酮D在两种处理方式中完全阻滞了p27脚1 mRNA水平的上调。实时定量PCR和Westernblot结果显示,与vehicle或MGl32处理组相比, 白藜芦醇单独或联合MGl32处理组都能明显增jJnFOX01的表达。Chip实验发现与单独使用白藜芦醇相比,白藜芦醇联合