植物病原线虫的分离方法及形态观察实验.doc

植物病原线虫的分离
一、目的要求
了解从土壤和植物组织中分离线虫的基本原理，掌握从土壤和植物组织中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中和滤纸上挑取线虫的方法。
二、基本原理
植物寄生线虫主要存在于土壤和植物组织中，分离线虫的方法有许多，要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出以外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能完成。线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小、比重以及与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将线虫从植物组织、土壤中分离出来。
三、材料、试剂与仪器
1．实验材料 感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。
2．仪器或实验用具 解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目和325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。
3．试剂 线虫固定液。
四、实验操作
1．直接观察分离
对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等，可直接用挑针从植物组织中挑取，也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取，对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫和幼虫等，需在解剖镜下，用竹针或毛针直接挑取。
取感染根结线虫的植物病根材料（若是干材料需用水浸泡过夜），剥开皮层，观察里面是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取，置凹玻片上水滴中，在解剖镜或显微镜下观察是否为根结线虫雌虫。
2．漏斗分离法
该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置是将直径10~ 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约 10 cm 的橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。
（1）将植物材料切碎用双层纱布包好，浸在盛满清水的漏斗中，或在漏斗衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将植物材料直接放在网筛中，分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸，上面加一层土样。
（2）加水，静止24h。
提示 由于趋水性和自身的重量，线虫就离开植物组织或土壤，沉降到漏斗底部的橡皮管中。
（3）打开弹簧夹，慢慢放出底部约5 ml水样于平皿。
（4）在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量太少，可将水样倒入离心管中，在1500rpm离心机中离心3 min，倒掉上层清水，将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中，在解剖镜下观察记数，然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。
提示 该方法也可用于分离土壤中的线虫，尤其是分离较为活跃的线虫。
3．培育分离法
对于用漏斗分离法不易分离到的线虫，如根结线虫和孢囊线虫的雄性成虫等，可采用培育分离法。
将病根采回后洗去表面土粒，放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d，用少量清水冲洗组织和皿底，检查水中线虫。或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中，加入几毫升清水，盖不要旋紧，在室温（20~ 25℃ ）下培育3d，然后加50 ml清水，盖紧盖子并轻轻振荡，后倒出悬浮液使其顺序通过40目和325目网筛，用小水流轻轻冲洗325目网筛背面，收集到记数皿或烧杯中，直接检查或离心后检查。
提示 从土壤中得到病根后要马上冲洗和培育，因为24h后，有50%的线虫会从根里爬出，冲洗时便被冲掉了。
4．浅盘分离法
该方法原理与漏斗分离法一样，但分离效果更好，而且泥沙等杂物较少。用两个不锈钢浅盘套放在一起，上面一个是筛盘，它的底部是筛网，网目大小为10目/英寸，下面一个是稍大的盛水盘。也可在培养皿上放置一个稍小的做成浅盘状的金属网，网与培养皿底部保持一定距离。
分离时将线虫滤纸放在网上用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，将要分离的土样或植物材料放在餐巾纸上，在两盘之间缝隙中加水，淹没土样或植物材料，在室温（20~ 25℃ ）下保持3d，去掉筛网后，将下面浅盘中的水样过筛（上层为25目，下层为400目），将下层筛上的线虫用小水流冲洗到记数皿中，观察记数。
5．漂浮器分离法
对于没有活动能力的孢囊线虫的孢囊可采用漂浮器分离法（Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法），该法需要特制的分离装置。分离时先将漂浮筒盛满清水，将 100g 风干的土样放在上筛中，用强水流冲洗土样，使其全部洗到漂浮筒，并从环颈水槽流到承接的细筛（100目）中，再用细水流冲洗一会，使漂浮物全部流入细筛。将细筛中的孢囊等漂浮物用水洗入烧杯或三角瓶中，再倒入铺有滤纸的漏斗中，用毛笔收集并观察滤纸上的孢囊。
提示 漂浮分离的土样必须要风干，否则孢囊不能在水中漂浮，需用比重小于1的溶剂。
五、所需时间流程
1．漏斗分离 样品浸泡 放出水浸液、离心