膜蛋白提取模板.doc

1分离组织膜蛋白方法:
1、 取组织, 加入10ml Buffer A 于冰上充足匀浆。
2、 J6-HC离心机800rpm, 4℃离心10min后, 所得上清液转入超速离心管。
3、 100000g, 4℃离心1hr。 弃去上清, 沉淀用适量 Buffer B重悬, 冰上孵育2hr后分装至EP管, Eppendorf台式离心机10000rpm, 4℃离心30min。
4、 搜集所得上清液即为膜组份。
Buffer A: 蔗糖, 5mM Tris-HCl（PH ）, 120mM KCl, 1mM EDTA,1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。
Buffer B: 20mM HEPES（PH ）, 10%甘油, 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。
2
, 加入2ml粉碎缓冲液, 冰浴中超声粉碎, 每次20秒, 间隔30秒, 共3次, 4°c 105xg条件下离心2小时, 上清液为胞浆蛋白, 沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液, 超声粉碎, 4°c 105xg条件下离心2小时, 上清液为 胞膜蛋白。 样品蛋白含量测定采取酚试剂法。
3
我们试验室提取膜蛋白方法以下:
1． 将细胞种于 T75 或T175培养瓶中培养数天, 细胞铺满瓶底后, 吸去培养液。 将PBS/EDTA 溶液(NaCl:,NaH2PO4:,EDTA:%)加入量以覆盖细胞为止, 置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟, 如仍未脱落瓶底, 用吸管吹打, 使细胞完全脱落。
2． 搜集细胞悬液于10毫升或50毫升离心管中, 1000rpm离心10分钟, 去上清液。
3． （T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰凉匀浆液（HEPES:50mM,,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中, 将溶液和沉淀转移到匀浆器中, 匀浆。
4． 将匀浆液转入离心管中, 加入适量Tris – HCl (50mM, ) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。 在沉淀中加入同前量匀浆液, 再匀浆, 匀浆后加入适量tris-HCl buffer. 4度 18000rpm(40000g)离心, 共离心三次。
5． 在最终一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer, 匀浆, 取50微升匀浆液测量蛋白浓度。
6． 按试验要求, 将匀浆分装于1毫升 Eppendoff 管中, 其于-80oC 冰箱中待用。
关键基于膜蛋白分子量较大, 在40000g时易沉降来分离。
做膜蛋白免疫荧光, 能够用荧光抗体染色, 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察, 具体protocol能够找到, 就不多说了。 需要注意是, 要搞清楚你所使用一抗结合部位是在膜蛋白胞外结构域还是胞内结构域, 假如是胞外, 能够直接染色; 假如在胞内, 则需要用无水甲醇在-20度处理10min, 使细胞膜通透, 然后再用抗体孵育, 这么抗体才能进入细胞内和蛋白结合。
4
通常对膜蛋白提取全部是采取梯度离心或高速离心方法分离, 可是我们现有离心机全部无法达成所需要转速, 所以我们试着采取分布溶解分布沉淀措施。
1） 预冷pbs洗去组织血液, 除去结缔组织、 脂肪。
2） 4 ℃剪碎, 加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物, 10 ℃超声波10min, 重悬, 再破碎5—10min。
3）1rpm离心10min, 沉淀用bufferB重悬, 20 ℃超声波10min。
4）1rpm离心10min, 沉淀用bufferC抽提。
5）1rpm离心10min, 所得上清含有9%膜蛋白。
6）1rpm离心10min, 沉淀加bufferD沸水煮5min, 1rpm离心10min, 上清含有1%膜蛋白。
bufferA: 40mM Tris base
bufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris base
bufferC: 6-7M urea, PMSF,40mM Tris base
bufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycero