2021年实验七实验注意事项.ppt

实验原理
磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
脯氨酸的测定
实验七实验注意事项
2021/1/14
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脯氨酸的测定
（一）材料及试剂
1. 材料：植物叶片。
2 .试剂及配制：
﹪酸性茚三酮溶液配制： 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。(配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。 )
3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
100μg·mL-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·mL－1脯氨酸母液）。
冰醋酸；甲苯。
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（二）实验步骤
1.   脯氨酸标准曲线的制作
用100μg·mL－1脯氨酸母液配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg /mL的标准溶液。取标准溶液2mL，然后向各管分别加入2ml 3％的磺基水杨酸溶液，加入2ml冰醋酸及4mL ﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热1h，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液 ，以甲苯溶液为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值。
OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（ μg /mL ）为横坐标绘制标准曲线。
回归方程式
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2. 样品的测定

，分别置大试管中，然后向各管分别加入5mL3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心10min。取上清液待测。

吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2mL 去离子水，2mL冰醋酸及4mL ﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热1h，溶液即呈红色。冷却后加入4mL甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻。
用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
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从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：

X × 提取液总量（mL）
脯氨酸含量（μg·g－1 Fw）＝ —————————————————
样品鲜重（g）× 测定时提取液用量（mL）
公式中：X －从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg/mL）
（三）计算结果
依据回归方程式计算得到脯氨酸含