抗菌肽天蚕素a截短肽高效表达、分离纯化及抗体制备.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文抗菌肽天蚕素A截短肽的高效表达、分离纯化及抗体制备摘要背景介绍近年来由于抗生素的大量使用,导致临床耐药株日益增多,故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。自从瑞典科学家Boman在惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)中发现抗菌肽以来,已有几百种抗菌肽被相继发现。抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速的特点,不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫, 部分还有一定抗恶性肿瘤作用,并且不易产生耐药性,对真核细胞毒性作用低等特点,备受关注。其相应的原核、真核、昆虫等表达体系也被构建。但由于其本身的抗菌活性,使其很难在原核细胞的工程菌中表达,而真核等系统的表达量却难以达到要求。与传统抗生素相比某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想,改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高活性的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系,为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。与抗菌肽相关的某些毒性作用、在动物机体内的稳定性等问题有待研究。但随本课题由国家自然科学基金资助(30600790) 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文着抗菌肽及转基因技术在理论和应用上更深入的研究,抗菌肽最终必将对人类医学产生深远影响。目的通过将天蚕素A(cecropin A,CA)截短肽的串连融合表达,降低其对工程菌的毒性和提高其表达产量,为其产业化提供可能的方法。比较CA其两个0【螺旋区域的活性是否一样,两个0【螺旋和一个0【螺旋的抑菌活性是否有区别,从而为改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子提高活性的途径,提供理论依据。通过了解CA的抗原性区域,制备高质量抗体,为以后更好的检测抗菌肽CA在异源表达系统中的表达情况及表达产量提供帮助。方法 l。使用蛋白质专家分析系统(ExPASy,/)的 PredictProtein程序分析CA序列的二级结构,PROSITE SCAN程序分析其功能位点。根据二级结构和功能位点分析,选取氨基酸区域1~19 作为CAl9,18--一36作为CA36,2~10和25~32通过GP连接作为 CA210。 ,并在每条单链的3’端加上ATG尾。将3对核苷酸单链分别磷酸化后退火延伸。(+)载体,转入大肠杆菌DH5a进行克隆,随机挑选菌落经PCR后用琼脂糖鉴定。重庆医科大学硕士研究生学位论文 (DE3)I-.进行串连融合表达,并优化诱导表达条件。选择优化后的诱导条件进行诱导表达,用 ,。 ,Br切割成单体,通过复性、冷冻干燥浓缩等步骤,分离、纯化和浓缩抗菌肽,用 。 、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检测其抗菌活性。用微量稀释法检测其最小抑菌浓度。 ,分别在第三、四次免疫一周后断尾取血,ELISA检测其效价。Western-blot鉴定其特异性。结果 、CA36、CA210的互补DNA双链经DNA连接酶作用后,成功构建了1~5个拷贝的串连体。琼脂糖电泳分析分别在其相应分子量的位置有特异性条带。转化入大肠杆菌DH50t的 pET一31b(+).CAl9(CA36、CA210)1"、,5质粒经菌落PCR鉴定、琼脂糖电泳分析正确后测序,其插入位置和序列完全正确,成功构建了CA 各截短肽的串连融合表达载体。 (CA36、CA210)1"---'5,在37。C、IPTG浓度为 、诱导时机为第2h加入、诱导3h后得到稳定的表达量,其中 、,%、%和 %。融合蛋白经SDS—PAGE分析,证实其大小一致, 鉴定有特异性条带。 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 90%以上。经CNBr切割获得单体,用Tricine 处可见~条特异的目的条带。 ,抑菌活性从大到小为CA210>CAl9> CA36。此外,通过微量稀释法得出各CA截短肽的最小抑菌浓度为16 txg/ml'--。1281ag/ml。 ,CAl9、CA36、CA210第三次免疫后的效价,分别为1:2 000、l:1 00