高效液相色谱法EP4.doc

　 液相色谱法(EＰ４）
液相色谱法（LC）是一种根据两种互不相溶的相之间种类分布的不同而进行色谱分离的方法。在这两种互不相溶的相中,移动相是一种渗过色谱柱中固定相的液体.
液相色谱法(LC)主要基于吸附、质量分布、离子交换、尺寸排阻或立体化学相互作用的原理。
仪器
液相色谱法的仪器包括：泵系统、进样器、色谱柱（可用柱温控制器）、检测仪和数据采集系统（也可用积分仪或图形记录器)。移动相从一个或多个贮器流出，通常以恒速经过色谱柱，再流经检测仪。
泵系统
液相色谱法所用的泵系统需以恒定流速输送移动相,应尽量减少压力波动,。液相色谱泵可以与能将系统中裹入气泡排出的设施相连接。
微处理器控制系统能根据设定好的程序准确地输送恒定(等度洗脱)或不同成分（梯度洗脱）的移动相。梯度洗脱时，泵系统从多个贮器发送溶剂，将泵调到低压或高压即可对溶剂进行混和。
进样器
用可在高压下使用的进样系统在（或靠近)色谱柱顶部将样品溶液注入流动着的移动相中。使用手动操作的固定回路变量装置或自动进样器进样。手动分次注入回路会降低进样量的精确度。
固定相
液相色谱法中使用的固定相有多种，包括：
二氧化硅、氧化铝或多孔石墨， 用于正常相色谱法。该方法是根据吸附和(或）质量分布的不同进行分离.
树脂或带酸基（或碱基）的多聚体，用于离子交换色谱法。该方法是在待分离的离子与移动相中的离子之间的竞争基础上进行分离。
多孔硅石或多聚体，用于尺寸排阻色谱法。该方法是根据分子量之间的不同进行分离的,与空间排阻法色谱法相对应。
多种由多聚体、硅石或多孔石墨经过化学变性的固定相,用于反相液体色谱法。该方法是主要根据移动相和固定相之间的分子隔离来进行分离。
—   经过特殊化学变性的固定相如纤维素或直链淀粉衍生物、蛋白质或肽、环糊精等，用于旋光对映体的分离（手性色谱法）
大多数分离都基于一种隔离机制,即用化学变性硅作固定相,用极性溶剂作移动相。载体（如二氧化硅的硅烷醇基)的表面与各种硅烷试剂发生反应，在载体表面产生以共价键联系的、。
现将常用的键合相列于下表中：
辛基
 ＝ 
Si－（CH2）7-CH３
C8
十八烷基
 = 
Sｉ-（CH2）17-ＣH3
C18
苯基
 = 
Ｓｉ—（CH２）ｎ-　（C6Ｈ5)
C６H５
氰基丙基
 ＝ 
Si－（CH2）3—ＣN
CＮ
氨基丙基
 = 
Ｓｉ－(CH2)3-NH２
NH2
二醇
 = 
Ｓi—（CH2)３－OCＨ（ＯH）—ＣＨ2—OH
除非制造商另有说明，使用二氧化硅的反相色谱柱在pH值为２。0～８。0的移动相中是稳定的。而装有多孔石墨或聚合物颗粒（如苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）的色谱柱在更宽的pH值范围内是稳定的。
在某些情况下，可用未改性的二氧化硅、多孔石墨或化学变性的极性硅(如氰基丙基或二醇）做固定相，加上非极性移动相进行正常相色谱分析.
用于分析分离时，最常用的移动相的粒度为3μm ～ １0μｍ不等。移动相的颗粒可以是不同孔径和比表面积的球状或不规则形状。这些参数构成了固定相的色谱特性。就反相来说，其固定相的性质、键合程度(如以载碳表示的)以及该固定相是否有尾帽（即残留的甲硅烷醇基已被甲硅烷基化）仍是其决定因素。当残留甲硅烷醇基存在时，会产生拖尾峰，特别是碱性物质的拖尾峰。
除非专论中另有规定，分析色谱法中使用的色谱柱应为不锈钢，其长度和内径各异(Ø）。 ，,但是可以给柱子加热，提高柱效。在给柱子加热时，建议温度不超过６0 °Ｃ，以免固定相老化或移动相的成分发生变化。
移动相
对正常相色谱分析法来说,其使用的极性溶液要少些。严格控制移动相中的水份，才能得到可再现的结果。而在反相液相色谱分析法中，则使用水性移动相（有机改性剂可有可无）.
移动相的组份通常需过滤,除去大于0。45 μm的微粒。多组份的移动相的制备方法是：（除非规定了质量）,可以用配量阀控制的单个泵来输送溶剂,所需的溶剂在配量阀中按比例进行混和。泵送前，通常用喷射氦、音波或在线膜（或真空模块)的方式以避免在检测器中产生气泡，从而脱去溶剂中的气泡。
配制移动相所有的溶剂通常不含稳定剂,若用紫外检测器，。