HE染色与免疫组织化学染色实验报告.doc

HE染色与免疫组织化学染色实验报告
实验目的及意义

掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法
熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识
2 实验方法及步骤
石蜡切片制作及HE染色步骤
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从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
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一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
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将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
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先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。
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将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
脱蜡至水
二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
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苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
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95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
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将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。
SABC 染色步骤
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二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
（水流要小）
%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。
，重复2次。
，，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。
，重复3次。
，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。
（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。
，重复3次。
（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。
，重复3次。
DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。
，重复2次。
，流水冲洗5分钟。
，70％酒精3分钟，80％酒精2分钟，90％酒精2分钟，95％酒精2分钟，95％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅰ2分钟，100％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅲ2分钟二甲苯Ⅰ8分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
，放入37℃烘箱。
3 实验结果
HE 染色结果
IB
IB
B
A
A
IB： 狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）
图1 狂犬病毒感染后脑组织病变 HE染色
A: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400; B: 脑神经元内多处包涵体x400
狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征