实验六SDS预习报告.doc

实验六SDS预习报告.doc实验六 SDS-PAGE测定蛋白质分子量 预习报告
生物111杨明杆1102040128
一、 研究背景
在生物学研究中，有时我们需要得到纯化后的蛋白质的分子量数据，一是可检验分离纯化的效果，二 是为后续研究做准备。例如作为蛋白质制剂，其分子量大小与安全性有密切关系，一般分子量越大产生过 敏性的可能越大，因而在蛋白制剂中控制检测分子量大小是一个重要课题。
蛋白质分子量测定方法有超速离心法、凝胶过滤色谱法等，但这些方法不够准确，实验室中用于测定 蛋白质分子量的方法较多用的是SDS—凝胶电泳法。这种方法最适宜测定分子量是15, 000- 100, 000的样品, 对低于10, 000分子量的水解蛋白不太适用。通过改进，用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子 量低于10,000的水解蛋白样品进行分子量测定。用这种方法测定蛋白质的分子量，分辨率高，所需设备廉 价，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，因而其广泛应用于蛋白分离纯化和分子量 测定。
实验四中，我们通过凝胶过滤层析获得了初步提纯的麦清蛋白。在进一步的研究当中，必然要测定其 分子质量。从实验五中，我们利用活性聚丙烯酰胺垂直板电泳实现了过氧化物酶同工酶的分离与定性分析， 了解了电泳技术是目前用于大分子分析鉴定的常用手段，因此，考虑采用电泳的手段实现测定麦清蛋白分 子质量的目的。
而要达到测定麦清蛋白分子质量的目的，首先则要使其不同的蛋白只按照分子量的差异分离开来。通 过实验五我们可以发现，在活性电泳中，不同蛋白质因各自电荷性质、分子人小和形状的不同，在一定pH 条件下，在电场中表现出不同的迁移率；可以实现不同蛋白的分离，但无法达到只按照分子量不同而分离。 而在1927年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂和少量毓基乙醇，则蛋白 质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。由此产生了蛋 白质变性电泳，目前常用的是SDS-PAGEo本次实验就将采用SDS-PAGE,实现对麦清蛋白分子质量的测定。
二、 研究目标
1、 学习和掌握垂直板行聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法。
2、 学习和应用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
三、 研究策略
本实验利用SDS-PAGE测定实验四纯化的麦清蛋白。首先加入SDS后，由于其与蛋白质结合成复合物 而形成的消除了电荷和分子形状影响的效应，使其能只按蛋白质分子量的差别对其进行分离，满足了对麦 清蛋白分子质量的测定；其次，由于电泳蛋白条带肉眼不可见，故采用考马斯亮蓝与蛋白质分子结合的显 色反应获得肉眼可见清晰的蛋白质谱带；再次，由于无法直接读出分子质量，我们采用标准蛋白同批次进 行实验的方法进行对照，在保证实验平行性条件下将待测蛋白与标准蛋白的条带进行对照，得到待测蛋白 的分子质量。
四、 研究方案和可行性分析
（一）研究方案
1、 在普通聚内烯酰胺凝胶电泳屮，蛋白质的移动速度与蛋白质所带电荷、蛋白质分子大小和形状有 关。如果在电泳系统中加入
SDS （十二烷基硫酸钠），即进行SDS-PAGE,那么蛋白质的迁移速度就只与分 子质量有关。这是因为SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，可以破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用， 在俟毓基乙醇的存在下，蛋白质二硫键断裂，