溶组织内阿米巴培养.doc

第十八章寄生虫的人工培养及动物模型第一节寄生虫的人工培养一、溶组织内阿米巴培养可分有菌培养(xenic culture) 和无菌培养(axenic culture) (一)有菌培养主要用 Robinson ’s 培养基,不仅可以培养溶组织内阿米巴,也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用 6ml~7ml 或更小的螺旋有盖培养管。 1 .组成成分: (1) 盐水琼脂斜面: 溶解 15g 琼脂粉和 7 g ~8g 氯化钠于 1000m l 蒸馏水中,分装在小试管中高压灭菌(121 ℃,15min) ,当琼脂冷却至 75℃左右倾放使其形成斜面。(2 )红霉素:将 实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中,加入 20ml 70% 乙醇溶解, 4℃放置 2h 以上,而后加灭菌水至 50ml 。(3 )米粉:梗米粉经高压消毒或 180 ℃干燥灭菌。(4 )配制 50mmol 邻苯二甲酸氢钾, ,高压灭菌。(5 )血清: 56℃ 30min 灭活,甚至未灭活的牛或马血清均可使用。(6)R 溶液贮存液: NaCl 50g (NH 4) 2 SO 4 10g 2O 20g MgSO 4 .7H 2O KH 2 PO 4 5g 乳酸(90% 纯度) 4ml ,加水至 950ml ,调节 pH至 ,最终调节容量至 1000ml , 分装高压灭菌, 制备成贮存工作液。使用时将 100m l 贮存液加入 850ml 双蒸水,调节 分装高压灭菌。(7) BR 溶液: 25ml R 工作液与 1 个克隆的大肠杆菌, 37℃振摇培养 48 小时。(8) BRS 溶液: 在上述 BR 溶液中加入等量血清, 继续培养 24~4 8 小时即可。 2 .操作步骤在含琼脂斜面的培养试管中加入 10mg 米粉、 120 ?l 红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和 BRS液 4:1 混合液, 加入少量(约 50mg) 粪便, 混匀, 37℃培养 24 小时后, 移去培养上清液, 加适量入 4:1 混合液并加入 60 ?l 红霉素和米粉。 37℃继续培养 48 小时后,取米粉与粪渣混合物一滴, 以碘液染色或直接观察有无滋养体; 若未发现虫体再加入米粉,再培养 24 小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养,即为转种。(二)无菌培养最常用是 BIS-33 培养基, 为液体培养基。培养在 6ml 的玻璃有盖培养管中, 由于阿米巴为兼性厌氧代谢, 故应紧盖管盖, 并呈 5 ?的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高, 甚至水质也会影响其生长, 并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功培养虫体。 BIS-33 培养基含三个组分,即营养液、维生素混合液、成牛血清。(1 )营养液: K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl 2g L~ 半胱氨酸~HCl 1g 维生素 C 枸橼酸铁胺 葡萄糖 10g 消化蛋白胨,酵母提取物 30g 溶于 600ml 双蒸水中,调节 pH至 ,最终容量调至 870ml ,分装,高压消毒后,冷却至-20 ?贮存。(2 )维生素培养液有多种,如下一种是最易配制的。溶液 A :烟酰胺 45mg; 盐酸维生素 B 6 4mg; 泛酸钙 23mg; 盐酸硫胺 5mg; 维生素 B 12 ,均溶于双蒸水,定容至 25ml; 溶液 B :核黄素 7mg( 加 NaOH 数微升使其易溶解) 加双蒸水至 45ml; 溶液 C: 叶酸 ( 加 NaOH 数微升使其易溶解) 加双蒸水至 45ml; 溶液 D: d- 生物素 2mg ,加双蒸水至 45ml; 溶液 E: DL-6,8- 硫辛酸 1mg ,溶于 5ml 95% 乙醇中,加入 500mg Tween 80 并定容至 200ml , ?m 滤膜过滤灭菌, 4℃暗处保存。(3 )成牛血清成牛血清需经 4 小时左右灭活方可用于培养,但需避免反复冻融。(4 )完全培养剂营养液 87ml , 成牛血清 10ml 或 15ml , 维生素混合液 2ml , 混合, 冷藏, 随时可用。应用 6ml 的螺旋有盖培养管, 36 ? ℃培养, 72~9 6 小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与 37℃的 BIS-33 培养基混匀, 使米粉等粗颗粒自然沉淀, 取含滋养体的上清液通过滤纸, 400 g 2min 离心,弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、卡那霉素、多粘菌素的 BIS-33 培养液中,并加入数滴福尔马林固定的短膜虫,在 6ml 螺旋有盖培养管中培养。 24 小时后