生化实验大纲.doc

实验一 3,5-二消基水杨酸比色定糖法
原理:本实验利用3,5-二消基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系,可用于比色测定。
操作方法:
葡萄糖标准曲线的制定
葡萄糖标准曲液的配制:准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖(预先在1050C干燥至恒重。浓度为1mg/mL。
测定:取九支25mm×250mm的试管,分别按下表加入试剂:
项目
0
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖标准液(mL)
0








相当于葡萄糖量(mg)
0








蒸馏水(mL)









3,5-二消基水杨酸试剂(mL)









将各管溶液混匀,在沸水中加热5分钟,取出后立即用冷水冷却至室温,,摇匀。
于520nm波长处测A值。以葡萄糖mg数为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
样品中总糖和还原糖含量的测定
样品中还原糖的提取:准确称取2g山芋粉,放在100mL烧杯中,先以少量水调成糊状,然后加50~60mL蒸馏水,于500C恒温水浴中保温20分钟,过滤,将滤液收集在100mL容量瓶中,再定容至100mL。
样品中总糖的水解及提取:准确称取1g山芋粉,放在锥形瓶中,加10mL6mol/L盐酸,15mL水,在沸水浴中加热半小时,取出一、二滴置于白瓷板上,加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈蓝色。冷却后加入1滴酚酞指示剂,以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色,过滤并定容到100mL。再精确吸取上述溶液10mL于100mL容量瓶中,定容至刻度,混匀备用。
样品中糖含量的测定:取7支25mm×250mm试管分别按下表加入试剂:
项目
空白
还原糖
总糖
0
1
2
3
4
5
6
样品溶液(mL)
0






蒸馏水(mL)
2






3,5-二消基水杨酸(mL)







加完试剂后,其余操作与制作标准曲线时相同。
测定后,取样品的A平均值在标准曲线上查出相应的糖量。用下式计算出山芋粉中还原糖与总糖的百分含量。
还原糖%
=
还原糖mg数×样品稀释倍数
样品重量
×100

总糖%
=
样品水解后还原糖mg数×样品稀释倍数
×100
样品重量
实验二 Folin-酚法测定蛋白质浓度
原理:本方法是一种化学方法。是利用蛋白质的肽键在碱性条件下,与甲试剂(酒石酸钾钠铜盐溶液)起作用,生成紫红色络合物。而且乙试剂(由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴组成)在碱性条件下易被蛋白质中的氨酸的酚基还原成兰色,其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
实验操作:
一、制作标准曲线和测定未知蛋白质溶液浓度
取14支试管,分两组按下表平行操作:
试管编号试剂处理
标准曲线
待测样品
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白质溶液/mL
0





—
待测蛋白质溶液/mL
—
—
—
—
-
—
x
去离子水/mL





—
-x
甲试剂/mL







混匀,于18-200C放置10min
乙试剂/mL







迅速混匀,于室温(18-200C)水浴保温30min,以去离子水为空白,在640nm处比色
A640(1)
A640(2)
A640
二、数据处理
(1)绘制标准曲线:以A640值为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
(2)计算待测蛋白质溶液的浓度:用待测蛋白质的A640 在标准曲线上查出其对应的蛋白质含量,根据实验中所加入待测蛋白质溶液的体积计算出其质量浓度(μg/mL或mg/mL)
实验三凯氏定氮法测定蛋白质浓度
实验原理:用浓硫酸消化,天然的含氮有机化合物分解出氨,氨与硫酸化合生成硫酸铵。(可借硫酸铜和硫酸钾来促进)消化完后,在凯氏定氮仪中加入