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第三军医大学
硕士学位论文
人肺腺癌细胞株A549通过Fas/FasL途径诱导T细胞凋亡的研究
姓名:王红梅
申请学位级别:硕士
专业:外科学(胸心外)
指导教师:张国强
2011-05
第三军医大学硕士学位论文
人肺腺癌细胞株 A549 通过 Fas/FasL 途径诱导 T 细胞
凋亡的研究

摘要

研究背景
癌症是世界范围内疾病死亡的重要原因,目前我国肺癌患者的死亡率占癌症死亡
率之首。传统的治疗手段包括手术、化疗及放疗等在内的综合治疗,但都没有很好的
治疗效果。肺癌容易早期远处转移、对放化疗不敏感等因素是治疗中的关键难题。研
究证实免疫逃逸机制是肿瘤在人体内的发病原因之一,针对免疫逃逸的靶向治疗也可
能成为攻克恶性肿瘤最有效的手段。诱导机体免疫细胞凋亡是肿瘤免疫逃逸的一种方
式,在肿瘤微环境中的肿瘤细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)相互作用,导致 TIL 发生
凋亡,已经证实 Fas 及其配体(FasL, Fas ligand)介导的受体凋亡途径参与并促进了这一
过程。Fas、FasL、FADD 及 caspase-8 是 Fas/FasL 介导的细胞凋亡过程中的核心成员,
在细胞凋亡过程中具有十分重要的作用;同时有研究结果显示细胞核内磷酸化
FADD(p-FADD)的高表达与肺癌的不良预后相关。由此可见,研究 Fas/FasL 机制中凋
亡相关分子在肺癌细胞诱导 TIL 凋亡过程中的作用,将有利于寻找针对肺癌治疗的新
靶标。
研究目的
本实验利用人 T 淋巴细胞株 Jurkat 作为活化的 T 细胞,设计以人肺腺癌细胞株
A549 诱导 T 细胞凋亡的细胞培养模型,研究肺腺癌细胞诱导 T 细胞凋亡时,Fas/FasL
介导的受体凋亡途径中 Fas、FasL 、FADD 及 caspase-8 等分子在 T 细胞中的表达变化
情况,寻找针对肺癌免疫治疗的新方法。
方法
1. 确定 A549 细胞及 Jurkat 细胞活性均在 95%以上。将对数生长期 A549 细胞与
对数生长期 Jurkat 细胞按数量比例(A549/Jurkat) 1:1, 10:1, 20:1, 50:1 共培养 6h,对照组
Jurkat 细胞只加入培养液培养;流式细胞术分别检测各组中 Jurkat 细胞凋亡率,确定
A549 细胞能成功诱导 Jurkat 细胞凋亡,并寻找最佳细胞作用比例。在此基础上将 A549
细胞与 Jurkat 细胞按数量比(A549/Jurkat)50:1 共培养 2h, 4h, 6h,对照组 Jurkat 细胞只
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加入培养液培养,流式细胞术分别检测各组中 Jurkat 细胞凋亡率,确定 A549 细胞诱
导 Jurkat 细胞凋亡的最佳培养时间。
2. 将 A549 细胞与 Jurkat 细胞按细胞数 50:1 共培养 6h,同时设只加 RPMI-1640
培养液的 Jurkat 细胞为对照组,采用 RT-PCR 及 Western blotting 分别检测各组 Jurkat
细胞表达 Fas, FasL, caspase-8 和 FADD mRNA 和蛋白表达情况,明确在 A549 细胞诱
导 Jurkat 细胞凋亡过程中,Fas/FasL 介导的受体凋亡途径中凋亡相关分子 Fas, FasL,
Caspase-8 及 FADD 的作用。
3. 基于前面的实验结果,将 A549 细胞与 Jurkat 细胞按细胞数 50:1 共培养 6h,并
将加入 caspase-8 抑制剂 Z-IETD-FMK 的另一组作为对照,流式细胞术检测两组中
Jurkat 细胞凋亡率,Western blotting 检测两组 Jurkat 细胞中 FADD 及 p-FADD 蛋白表
达情况,并采用激光共聚焦扫描荧光显微镜检测 FADD 及 p-FADD 蛋白在 Jurkat 细
胞中的分布情况,从而明确 caspase-8 及其抑制剂 Z-IETD-FMK 在肺腺癌细胞免疫逃
逸过程中的部分分子机制。
结果
1. 人肺腺癌细胞株 A549 可以成功诱导人 T 淋巴细胞株 Jurkat 凋亡,随着 A549
细胞与 Jurkat 细胞数量比例从 1:1 逐渐增加到 50:1,Jurkat 细胞凋亡率呈显著升高趋势
(P<);同时,当 A549 细胞与 Jurkat 细胞以 50:1 共培养,作用时间由 2h 延长到 6h
后,Jurkat 细胞凋亡率也显著增高(P<),但 2h 组与 4h 组、4h 组与 6h 组之间无显
著差异(