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第一章地衣共生菌藻的分离与培养地衣是一种真菌,由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌(蓝藻)的共生而形成的联合体,属“二元”生物体。在这个二元共生联合体中, 真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题: 地衣是否可分为单个生物体?地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。对于共生体的分离和培养研究, 为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养, 这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。地衣共生体的培养曾经被认为难以进行, 这主要是因为这是一项很耗时的工作, 而且共生体的培养是否成功需要长期的技术探索。然而, Ahmadjian ( 1967b ) 突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。在过去的二三十年间, 关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就, 如图一所示,地衣共生菌藻培养可以通过各种不同的方法而实现。地衣共生体的培养很难, 即使用具富营养的培养基。主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。此外, 霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以防污染。本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。子方案 I 讲述了地衣共生菌培养的各种方法。子方案 II 讲述了地衣共生藻培养的各种技术。这些培养技术已有报道, 但我们在此研究的基础上又添加了一些新的内容。关于共生体的分离技术已有 Ahmadjian ( 1967a,b )和 Galum ( 1988 )全面的描述了。子方案 I 共生菌的培养注意: 除了每一个清洗步骤, 所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。所有的仪器在用之前都应高压灭菌( 15~20 分钟, 121 ℃,1 atm )或干热灭菌( 30 分钟, 180 ℃)。一、仪器与材料仪器: 显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。真菌来源: 我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。然而地衣也可以在干燥状态下保存几周, 或在冰箱内存放几年( Yoshimura et al. 1990) 。共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来( Ahmadjian 1993 )。用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是: 孢子释放法, 主要是子囊孢子。获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片, 这样会形成大量较纯的共生菌, 在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。保存在 Akita profectue University 和 Kochigakuen college 的培养真菌可见表 1。(P7- 13)。真菌培养基: Ahmadjian ( 1993 )和P yatt ( 1973 ) 建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。可在 15℃黑暗条件下,采用含水 4% 的琼脂培养基以取得了较好的效果。这类共生菌的培养基如下: WA4 培养基——含 4% 蒸馏水的琼脂培养基琼脂 4克蒸馏水补足 100 ml MY 培养基——麦芽酵母提取物培养基( ahmadjian 1967 a) 麦芽提取物 20克酵母提取物 2克琼脂 20克蒸馏水蒸馏水补足 1000 ml LB 培养基—— Lilly and t ’s 培养基( Lilly 和 t 1951 ) 葡萄糖 克天冬酰胺酸( Asparagine) 克 KH 2 PO 4 克 MgSO 4? 7H 2O 克 Fe( NO 3) 3? 9H 2O mg ZnSO 4? 7H 2O mg MnSO 4 4H 2O mg 维生素 B1 ( Thiamine) mg 维生素 H( Biotin) 5 ug 蒸馏水补足 100 ml 可以在以上组分上加入 15~20 g 的琼脂, 并补足 1000 ml , 并制成固体培养基。 LBG 培养基—— L illy and t ’sG elrite 培养基 LB 培养基中以 1% 的 w/v G elrite 代替琼脂。注意: 在利用和倒入皮氏培养皿( 5mm ) 或试管( 5ml ) 之前, 应将所有培养基进行灭菌。二、实验步骤(一)通过孢子分离出共生菌孢子释放: 1. 把野外采集的地衣体洗净,放置几天使其于周围环境达到水分平衡。也可以将材料清洗和冷冻,在用之前平衡几个小时。 2. 从地衣体上取下子囊盘或子囊壳,并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡 4 小时或在流动水中清洗。通过挤压去除多余的水分。 3. 将其用凡士林固定在皮氏皿底部, 然后用含水 4% 的琼脂培养基盖在培养皿