PI染色.docx

PI染色.docxPI 染色
荧光染料 PI （碘化丙啶）是一种可对 DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是 Propidium Iodide 。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链 DNA后释放红色荧光。尽管 PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。 PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者 FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为 535 nm
615 nm。
PI 可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素 -AM(Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高， 使其可透过细胞膜。 尽管 Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用， Calcein -AM能脱去 AM 基，产生的 Calcein 能发出强绿色荧光（激发： 490 nm，发射： 515 nm）。因此 Calcein -AM 仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核， 并嵌入细胞的 DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发： 535 nm，发射： 617 nm）。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。 由于不同细胞系的最佳染色条件不同， 我们建议个别
确定 PI 和 Calcein -AM 的合适浓度。
．试剂
Calcein-AM PI
．用荧光显微镜观察细胞形态
HeLa细胞染色为例 , 请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。１．染色溶液的配制
1）用 1 ml 无水 DMSO溶解 1 mg Calcein-AM ，制备成 1 mmol/l 的 Calcein-AM 储
备液， -20 ℃下密闭冷冻保存。
的 PI 储备液（ 1 mg PI/1 ml
2）用 1 ml ddH O溶解 1 mg PI ，制备成 mmol/l
2
H2O），-20 ℃下密闭冷冻保存。
3）将 Calcein-AM 储备液和 PI 储备液放置于室温。
4）加 10 μl Calcein-AM 储备液和 15μl PI 储备液至 5 ml PBS 中配制成染色
溶液。
Calcein-AM 的终浓度为 2 μ mol／l ，PI 的终浓度为 4μmol／l 。
2．细胞染色
1）染色 HeLa细胞等贴壁细胞时 , 先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞，制备成细胞悬液。
2）将细胞悬液离心 3分钟 (1,000 rpm) 。
3）去除上清液，加入 PBS缓冲液，细胞数量调整至 105 –106 个／ ml。再用移液器充分混匀。
4）由于培养基中的血清等含有酯酶， Calcein-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用 PBS洗涤