牛病毒性腹泻病毒e0基因表达及间接elisa检测方法建立.pdf

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名: 时间: 年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文,允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 时间: 年月日导师签名: 时间: 年月日本文是自治区高技术发展计划项目“牛病毒性腹泻/粘膜病检测试剂盒研制与核酸疫苗建”的部分研究成果(项目编号:201010101) 课题主持人:冉多良教授(新疆农业大学) I 牛病毒性腹泻病毒E0基因的表达及间接ELISA检测方法的建立摘要牛病毒性腹泻粘膜病是牛的一种接触性传染病,此病可以感染各个年龄段的牛,在全世界广泛分布。该病能引起患畜高热、口腔及鼻内粘膜出血或产生大量粘液、母牛奶量减少甚至停止产奶、怀孕母牛流产或产死胎、畸形胎等症状。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒和羊边界病毒在血清学上有交叉反应。在 BVDV的结构蛋白中,E0基因保守性较高,并且具备一定的免疫原性,因此可作为基因工程的诊断抗原或用于研究基因工程亚单位疫苗。本研究根据已发表的BVDV-E0基因序列设计一对特异性引物。将Oregon C 24V标准毒接种于MDBK细胞中增殖并收集病毒液,从病毒液中提取RNA。以 RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出了921bp的E0基因。之后构建pMD18-T-E0 克隆载体,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。随后利用含有表达E0蛋白的重组质粒pET28a-E0转化至表达菌BL21(DE3)中,经培养诱导表达出重组E0蛋白, 经Western blot显示,纯化后的的重组E0蛋白的分子量大小为34kD左右,能与 BVDV阳性血清反应,具有生物学活性。用纯化后的E0蛋白作为包被抗原,/ 孔,血清最佳稀释度为1:160。特异性试验与重复性试验的结果表明,所建立的间接ELISA 检测方法特异性较好,变异性也较小。与商品化BVDV抗体检测试剂盒相比,%,%,说明该间接ELISA方法具有较小的误差。关键词:牛病毒性腹泻病毒;E0基因;原核表达;间接ELISA方法 II Prokaryotic Expression of E0 Gene of BVDV and Establishment of Indirect ELISA Using the Expressed Protein Abstract Bovine viral diarrhea mucosal diseasewas acontagious disease,which can infect all ages of cattle,existing all over theworld. This disease can cause patient high fever, oral and nasal mucosal bleeding or mucusoversecretion,reduction of milk production even off production,pregnant cow abortion or stillbirth,featus anomaliesand other has serologicalcross-reactionswithCSFV,and E0 gene, which exists in the BVDV structural proteins,can serve as diagnostic antigen or subunit ine in ic engineering,because of E0 gene’s high conservative propertyand immunogenicityto some extent. Apair of specific ording to the publishedBVDV-E0 gene sequencesin this article. Oregon