溶菌酶试验综合型实验(实验报告定稿).doc

1 第1章引言生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础, 从分子水平上认识生命现象, 已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别, 把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳, 超速离心, 超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性, 防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物, 应注意它的生长期, 在微生物的对数生长期, 酶和核酸的含量较高, 可以获得高产量, 以微生物为材料时有两种情况:(1 )得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2) 利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 1. 蛋白质的分离纯化 蛋白质(包括酶)的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的 1-5 倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5 度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。下面着重讨论提取液的 pH 值和盐浓度的选择。(1) pH 值蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的 pH 值应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。(2) 盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶, 称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合, 具有保护蛋白质不易变性的优点, 因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性盐, 一般以 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 - 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 有机溶剂提取法 2 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的 pH 及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: . 1. 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加, 此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的 SO4 和 NH4) 有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层, 使之“失水”, 于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。影响盐析的因素有:(1 )温度:除对温度敏感的蛋白质在低温( 4 度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度( 25 度)比 0 度时溶解度低,更容易盐析