两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活.doc

检测纤维素酶酶活力-滤纸酶活力(FPA)
滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活.
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法）
1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将3,5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基,溶液变为橙色的氨基化合物,即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：
滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素 。：以滤纸为底物，在一定反应条件(，50℃,恒温lh）下， 以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA）的测定：
取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4。8，0。1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液lml;
再加入50±(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时,(先预热5分钟）；
加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1。5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；
同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照,扣除本底；
根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值.
滤纸酶活按下面公式计算:
X=（WxNxlOOO）／(TxM)
X：为滤纸酶酶活力，单位U／mL.
W: 为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N： 为酶液稀释总倍数。
T： 为反应时间。
M： 为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法
标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1。0 mg /、、0。8、1。2、1。6、2。0ml，、、1。2、、、， ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却,用水定容至25 ml,摇匀，测吸光度A,以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线.
5、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂
称取6。3克3，5-二硝基水杨酸用水溶解,，182克酒石酸钾钠,加500ml水，。0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法
定义:1毫升液体酶(或1克固体酶粉），在40℃ pH﹦4。6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1。0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
原理：
CMC—Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，-Na糖化力主要代表内切β-1。4-葡聚糖的活力。
试剂:
0。1